水稻RAD21同源基因RIX4的分子特性研究

论文题目: 水稻RAD21同源基因RIX4的分子特性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 郭小勤

导师: 李德葆

关键词: 水稻,基因,白叶枯菌,稻瘟菌,选择性剪接,剪接模式,转录本,原核表达,多克隆抗体,干涉,基因枪法,光温敏核不育水稻,阵列,基因表达谱,信号传导

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本论文前期工作中,通过mRNA差别显示获得了受白叶枯菌（Xanthomonas oryzae pv.oyzae）诱导表达的差异cDNA片段。国际互连网Blastn查询表明该基因为新基因。本课题旨在对这一与白叶枯菌抗性相关的基因进行进一步研究。应用RT-PCR技术获得了该基因完整ORF序列,该序列全长2,187bp,编码一个728氨基酸的预测蛋白,分子量约为80.35KD,等电点为4.65。经序列拼接获得该基因的约5.3kb的基因组DNA序列,将该基因组DNA序列与eDNA序列进行比对分析,发现RIX4基因含11个外显子和10个内含子,所有10个内含子都符合保守的/GT-AG/特征。Blastp分析结果表明,RIX4蛋白在N末端含Pfam04825,在C末端含Pfam04824保守结构域,这两个保守结构域在RAD21/REC8类蛋白中很保守,表明RIX4蛋白属于RAD21/REC8类粘合蛋白。其蛋白的二级结构由21.98% a-螺旋,7.01%延伸和71.02%随意卷曲三种结构模块组成。在不育系和保持系水稻花粉母细胞减数分裂期幼穗中得到了RIX4基因另一转录本RIX4-5片段。对RIX4基因的5个转录本进行了序列和剪接模式的分析,结果表明第6和第7外显子序列的选择性剪接模式属于常见的选择外显子上不同的5’或3’剪接位点进行选择性剪接的模式,而第6和9外显子上序列的选择性剪接模式不符合常见的7种剪接模式,是一种新的剪接模式。稻瘟病菌的侵染有利于RIX4基因前体mRNA剪接形成RIX4-1转录本,白叶枯病菌的侵染有利于RIX4基因前体mRNA剪接形成RIX4-4转录本。运用大肠杆菌原核表达系统表达出RIX4多肽,并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,以此抗体检测了植物体内RIX4蛋白的含量。在受病原菌CR3诱导的水稻IR26愈伤组织中,在诱导0～60min的水稻愈伤组织中均能检测到RIX4基因编码的全长蛋白,而且随着诱导时间的延长,检测到的蛋白量增多。在处于花粉母细胞减数分裂旺盛期的不育系和保持系的幼穗中,保持系中RIX4蛋白含量均高于不育系。在受白叶枯菌CR3侵染不同时期的IR26愈伤组织和不育系及保持系幼穗中仅能检测到RIX4基因的全长蛋白,而检测不到其它转录本所编码的蛋白。在受稻瘟菌生理小种ZB15（2001-046）诱导的近等基因系H7R和H7S的叶片及生理小种01-14诱导的嘉兴02-03和中早27的叶片中,RIX4蛋白含量会随着诱导时间的变化而变化,在不同的水稻品系中变化趋势不同,但在受稻瘟菌诱导的水稻叶片中均能检测到全长蛋白和RIX4-4转录本所编码的蛋白,在蛋白水平上证明了RIX4基因存在不同的转录本。构建了RIX4基因RNA干涉表达载体,通过基因枪法对水稻粳稻品种中花11进行转化,获得9株转pCAMBIA-HANNIBAL-RIX4（461）质粒的转基因植株和12株转

论文目录:

摘要

Abstract

第一章文献综述

1 mRNA选择性剪接的普遍性

2 mRNA选择性剪接的基本形式

3 mRNA选择性剪接的生物学意义

4 mRNA选择性剪接的调控机制

4．1 剪接体的组装

4．2 剪接位点的识别

4．3 剪接因子调控 mRNA选择性剪接

4．4 RNA的转录和加工调控mRNA选择性剪接

4．5 mRNA选择性剪接的调控信号

4．6 GC-AG型内含子的剪接

5 mRNA选择性剪接的功能

5．1 终止密码子的导入

5．2 新蛋白部分的增加

5．3 对mRNA功能的影响

5．4 在生物学系统中同等变化的例子

5．5 选择性剪接是产生细胞特异性蛋白的一种重要机制

6 mRNA选择性剪接的分析策略

6．1 mRNA选择性剪接的微阵列研究

6．2 用比较基因组学的预测选择性剪接外显子

6．3 剪接的图例、异构体和剪接模式

6．4 mRNA选择性剪接的调控

7 本研究的目的、意义和主要研究内容

参考文献

第二章 RIX4基因序列的分析及启动子序列分析

1 材料与方法

1．1 植物材料与处理

1．2 水稻基因组DNA的提取

1．3 水稻总RNA的提取及痕迹量基因组DNA的去除

1．4 RT-PCR反应

1．5 PCR产物纯化

1．6 感受态细胞制备方法

1．7 连接

1．8 连接产物转化大肠杆菌

1．9 重组质粒的筛选与鉴定

1．10 DNA序列的测定和分析

1．11 启动子序列预测

2 结果与分析

2．1 RIX4基因全长ORF序列的获得

2．2 RIX4基因基因组结构的分析

2．3 RIX4蛋白是一种 RAD2I类蛋白

2．4 RIX4蛋白二级结构的预测

2．5 RIX4基因启动子顺式作用元件分析

3 讨论

参考文献

第三章 RIX4基因选择性剪接模式分析

1 材料与方法

1．1 植物材料与处理

1．2 水稻总 RNA的提取及痕迹量基因组DNA的去除

1．3 RT-PCR反应

2 结果与分析

2．1 RIX4基因转录本的搜索

2．2 RIX4基因各转录本序列的分析

2．3 RIX4基因的剪接模式分析

2．4 RIX4基因各转录本在受稻瘟病菌诱导的水稻群体中的表达谱分析

2．5 RIX4基因各转录本与表型的关系

3 讨论

参考文献

第四章 RIX4蛋白的western blot分析

1 材料与方法

1．1 植物材料与处理

1．2 菌株和载体

1．3 工具酶和试剂盒

1．4 其它试剂

1．5 RIX4基因片段克隆和原核表达载体构建

1．6 外源基因在大肠杆菌中的表达、蛋白质纯化和抗体制备

1．7 Western blot印迹分析

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第五章 RIX4因反向重复植物表达载体的构建及转基因水稻的分析

1 材料与方法

1．1 供试水稻品种

1．2 菌株及质粒

1．3 酶及生化试剂

1．4 反向重复植物表达载体构建

1．5 基因枪轰击法转化水稻

1．6 转基因植株的鉴定

1．7 转基因植株的抗病性分析

2 结果与分析

2．1 RIX4基因第一目的片段的克隆和反向重复植物表达载体的构建

2．2 RIX4基因第二目的片段的克隆和反向重复植物表达载体的构建

2．3 转基因植株的获得

2．4 转基因植株的PCR鉴定

2．5 T1代转基因植株的病原接种鉴定分析

3 讨论

3．1 内含子的使用及反向重复植物表达载体构建策略

3．2 基因枪轰击法转化水稻

参考文献

第六章水稻光温敏核不育系培矮64S在不同光周期温度下表达谱的变化

1 材料与方法

1．1 植物材料

1．2 RNA抽提

1．3 cDNA阵列探针标记

1．4 cDNA阵列制备

1．5 cDNA阵列杂交和数据提取

1．6 实时荧光定量RT-PCR

1．7 电子定位

1．8 2个表达上调未知基因的生物信息学分析

2 结果与分析

2．1 芯片杂交结果及数值信号分析

2．2 短日照/低温和长日照/高温条件处理下样本间基因表达谱差异分析

2．3 差异表达基因的功能分类

2．4 参与信号传导的差异表达基因

2．5 表达量差异明显的部分基因电子定位

2．6 两个差异表达最明显的功能未知基因的生物信息学分析

3 讨论

3．1 育性控制与蛋白质合成

3．2 育性控制与能量合成

3．3 育性控制与亚细胞定位和热激蛋白

3．4 总结

参考文献

附录

致谢

发布时间: 2006-07-24

参考文献

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[10].不同水稻品种对氮素响应的差异及其农艺生理性状[D]. 剧成欣.扬州大学2017

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