马铃薯茎尖超低温保存及超低温疗法脱毒技术体系的建立

论文摘要

植物种质资源的收集和保存是新品种选育的前提条件。超低温保存被认为是植物种质资源长期保存最理想、最有效的方法。马铃薯（Solanum tuberosum）是全球及中国第四大粮食作物。国际上,马铃薯茎尖的超低温保存自上世纪70年代以来已有大量的研究。马铃薯种质资源的超低温基因库已在国际马铃薯中心和德国建立,并投入应用。中国是世界上马铃薯生产第一大国。马铃薯茎尖超低温保存的研究起步晚,到目前为止仅有四例报道。马铃薯病毒病害是制约马铃薯优质、高产的关键因素之一。带毒种薯可导致马铃薯减产30-50%。无毒化栽培是目前生产上防治马铃薯病毒病害最有效的方法,脱毒技术是生产无毒苗的关键技术。茎尖培养被广泛用于马铃薯脱毒,但是茎尖培养取材困难、脱毒率低。最新的研究表明,茎尖超低温疗法能有效地脱除包括病毒在内的病原菌,已成为一项新的脱毒技术。有关马铃薯茎尖超低温脱毒仅有一例报道。本研究旨在建立广谱高效的马铃薯茎尖超低温保存技术体系,为马铃薯种质资源超低温库的建立奠定基础,并以马铃薯茎尖超低温保存技术为平台,开展超低温疗法脱除马铃薯病毒的研究。本研究以中国主栽马铃薯品种“紫花白”为试材,通过优化影响小滴玻璃化法（droplet-vitrification）超低温保存成活与植株再生的关键因素,成功地建立了中国马铃薯离体茎尖的小滴玻璃化法超低温保存技术。技术要点是:从3周龄的试管苗上,取0.5 cm带有顶芽的茎段,培养在Murashige and Skoog （1962, MS）培养基上,置于4℃黑暗条件下炼苗3周后,剥取长2-3 mm的茎尖,在含有0.3M蔗糖的MS培养基上预培养3天。预培养后的茎尖在室温下转入加载液（2M甘油+ 0.4M蔗糖+ MS）中加载20分钟,然后在0℃条件下用植物玻璃化液（Plant vitrification solution 2, PVS2）处理40分钟。将茎尖转到铝箔条（2cm x 0.5cm）上的小滴（含6μl PVS2）中,直接投入液氮中保存1个小时。超低温保存后的茎尖在含有1.2M蔗糖的MS溶液中解冻和卸载20分钟后,转入成活培养基上暗培养三天,再转入再生培养基中在光照条件下成苗。该技术获得了高达100%的成活率和70%的再生率。将已建立的超低温保存技术用于测试13个中国主栽的马铃薯品种,获得了平均90%和50%的成活率和再生率。上述结果表明,本研究建立的技术体系具有高效性和广谱性。利用ISSR（Inter-simple sequence repeat）分子标记技术对超低温保存后再生的植株进行了遗传稳定性的鉴定,结果表明,再生植株没有发现遗传变异。建立了马铃薯Y病毒（PVY）和马铃薯卷叶病毒（PLRV）的酶联免疫血清法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和反转录-聚合酶链式反应法（Reseved transcript polymerase chain reaction, RT-PCR）检测技术。以感染PVY的马铃薯“紫花白”和感染了PLRV的Desiree试管苗为试材,利用已建立的小滴玻璃化法超低温技术处理茎尖,获得了高达100%和70%的成活率与再生率,再生植株的带毒状况正在检测中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 马铃薯种质资源的超低温保存
• 1.2 超低温保存后再生植株的遗传稳定性
• 1.3 马铃薯病毒病的危害及常规脱毒技术
• 1.4 茎尖超低温疗法（Cryotherapy）脱毒
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 外植体的建立
• 2.2.2 超低温保存体系的优化和建立
• 2.2.3 ISSR 分子标记鉴定超低温保存再生植株的遗传稳定性
• 2.2.4 马铃薯病毒的检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 外植体的建立
• 3.2 超低温保存体系的优化与建立
• 3.2.1 PVS2 处理时间对马铃薯茎尖超低温保存成活率的影响
• 3.2.2 加载液成分对马铃薯茎尖超低温保存成活率的影响
• 3.2.3 加载时间对马铃薯茎尖超低温保存成活率的影响
• 3.2.4 预培养糖浓度对马铃薯茎尖超低温保存成活率的影响
• 3.2.5 预培养时间对马铃薯茎尖超低温保存成活率的影响
• 3.2.6 低温炼苗时间对马铃薯茎尖超低温保存成活率的影响
• 3.2.7 茎尖大小对马铃薯茎尖超低温保存成活率的影响
• 3.2.8 再生培养基对马铃薯茎尖超低温保存植株再生的影响
• 3.2.9 小滴玻璃化法超低温保存在中国主栽的马铃薯 13 个品种中的应用
• 3.2.10 马铃薯茎尖超低温保存的体系流程图
• 3.3 ISSR 分子标记法检测经超低温保存后再生植株的遗传稳定性
• 3.3.1 超低温保存再生植株DNA 的提取
• 3.3.2 ISSR-PCR 反应电泳结果
• 3.4 马铃薯试管苗带毒状况检测
• 3.4.1 ELISA 检测结果
• 3.4.2 RT-PCR 检测结果
• 第四章 结论与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 硕士期间发表论文