论文摘要
近年来免疫抑制剂的研究得到了很大的发展,并在临床应用中取得良好的效果,但移植后急性排斥反应仍然是导致移植肾功能丧失的重要原因。因此,急性排斥反应的早期诊断、干预和诱导免疫耐受,对移植肾功能的恢复具有重要意义。随着对急性排斥反应中移植物分子生物学的深入研究,细胞因子在器官移植急性排斥反应发病机制中的作用得到广泛重视。移植术后对某些细胞因子的表达进行检测并干预以防治急性排斥反应是当前器官移植领域的研究热点。目前IL-2在肾移植急性排斥反应中的作用已得到充分的阐明,通过抑制IL-2受体能有效的预防急性排斥反应的发生。但动物实验和临床移植中阻断IL-2/IL-2受体不能完全控制急性排斥反应的发生,说明机体内存在有独立于IL-2/IL-2受体系统之外的其它T细胞激活途径。但对于其它细胞因子的激活途径研究较少。IL-18是巨噬细胞、树突状细胞等分泌的细胞因子。IL-18作为IFN-γ的诱导因子,在调节免疫方面具有重要的作用,主要参与Th1的调节。最近研究发现,在不同的免疫微环境下,IL-18对Th2也具有诱导作用。在移植免疫中,Th1细胞主要参与免疫排斥反应,而Th2细胞主要参与免疫耐受,而IL-18作为Th1和Th2细胞的调节因子,在器官移植中具有重要的作用。最近研究发现在肝脏、肾脏、心脏和骨髓移植的急性排斥反应早期有IL-18的高表达,说明IL-18参与急性排斥反应的发生。虽然对肾移植早期急性排斥反应是IL-18和iNOS的检测在国内外已有研究报道,但对于IL-18在肾移植急性排斥反应发病机制中的作用以及它与其它细胞因子的相互作用和穿孔素、iNOS在移植肾中的损伤机制报道较少,有待进一步的研究,特别是关于抗IL-18抗体在大鼠肾移植中诱导免疫耐受,在国内外未见有报道。本研究创新之处在于:（1）关于IL-18在大鼠肾移植急性排斥反应中可能通过和IL-12的协同作用,激发IFN-γ的大量释放,抑制IL-10的产生,促使Th1/Th2细胞因子平衡向Th1转移,诱导急性排斥反应的发生,在国内外未见报道;（2）最近在国外有关于大鼠肾移植中IL-18和iNOS参与移植肾的损伤的报道,但关于IL-18、穿孔素和iNOS共同参与大鼠移植肾急性排斥反应中的损伤机制未见有报道。（3）在大鼠肾移植排斥反应中使用抗IL-18抗体诱导免疫耐受在国际上是首次报道。本研究在构建大鼠肾移植模型的基础上探讨IL-18、IFN-γ、IL-12、IL-10、iNOS和穿孔素在肾移植急性排斥反应中的表达变化,以及抗IL-18抗体对急性排斥反应的干预作用。研究分四个部分:第一部分大鼠肾移植急性排斥反应模型的建立目的:建立稳定可靠的大鼠肾移植急性排斥反应（AR）模型,为大鼠肾移植AR基础研究提供依据。方法:异系移植组由雄性Wistar大鼠为供体,雄性SD大鼠为受体。同系移植组供受体均为SD大鼠。在显微镜下,采用标准的供受体动静脉端端吻合,供体输尿管-膀胱瓣和受体膀胱吻合。于肾移植术后第3、5、7天收集心脏血行BCr及BUN检测,移植肾组织行HE染色光镜下观察病理改变,参照Banff 97标准进行AR严重程度的半定量评分。结果:两组术后并发症发生率较低。与同系移植组比较,术后第3、5、7d异系移植组BCr及BUN明显升高（P均<0.05）,于第7d达到高峰。术后第3、5、7天异系移植组和同系移植组的半定量评分分别为（ 1. 52±0. 46 ）、（ 3. 67±1. 14）、（ 5.61±0. 35 ）和（ 0. 61±0. 49）、（0.65±0. 52）、（0. 71±0. 38）。两组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。异系移植组中第3、5、7d,两两比较差异有统计学意义（P<0.05）,同系移植组各时间段的评分差异无统计学意义（P>0.05）。结论:采用此方法,可减少对受体循环系统的影响及避免尿路狭窄。SD大鼠间组织相容性高, SD大鼠作为供受体的大鼠肾移植排斥反应轻微,可作为同系对照组;Wistar-SD大鼠间肾移植AR发生快,程度重,是良好的AR动物模型。该模型稳定性强、重复性好,适合于移植免疫的基础研究。第二部分IL-18在大鼠肾移植中诱导IFN-γ导致急性排斥反应目的:通过比较动态观察IL-18、IL-12、IFN-γ和IL-10在大鼠肾移植术后移植肾mRNA表达和血清中浓度变化,以及IL-18在巨噬细胞中的表达,探讨IL-18在急性排斥反应中对Th1/Th2细胞因子平衡的影响及IL-12和IL-18在急性排斥反应中的协同作用。方法:建立大鼠肾移植模型,将大鼠分为三组:同系移植组（Syn组） （SD-SD） （n=24）;急性排斥反应组（AR组）（Wistar-SD）（n=24）;CsA组:（Wistar-SD）（n=24）。于移植术后第1d、3d、5d、7d,每组处死受体鼠各6只,收集受体鼠的血液、移植肾和脾脏。分别采用ELISA和Real-time PCR检测血液中IL-18、IL-12、IFN-γ和IL-10浓度和移植肾组织中IL-18、IL-12、IFN-γ和IL-10 mRNA表达。采用流式细胞仪检测术后第7d IL-18在巨噬细胞中的表达。结果:与Syn组及CsA组比较,AR组在术后第1、3、5、7d,IL-18、IL-12、IFN-γ在血清中的浓度明显升高（P均<0.01）,同时其在移植肾组织中的mRNA表达也明显升高（P均<0.01）。在AR组内,血清IL-18、IL-12、IFN-γ水平第5d及第7d明显高于第3d（P均<0.01）,同时其在移植肾组织mRNA表达也是第5d及第7d明显高于第3d（P均<0.01）。相反,和Syn组比较,在术后第3、5、7d,血清IL-10水平及移植肾组织中的mRNA表达在AR组中明显下降（P均<0.01）。而与Syn组比较,术后第3、5、7d,血清IL-10水平及移植肾组织中的mRNA表达在CsA组中明显升高（P均<0.01）。在流式细胞检测中,IL-18在巨噬细胞中表达的阳性百分率在AR组最高。结论:在大鼠肾移植急性排斥反应中,IL-18主要来源于巨噬细胞,可能通过和NK细胞分泌的IL-12协同作用,激发IFN-γ的大量产生,抑制IL-10的产生,促使Th1/Th2细胞因子平衡向Th1转移,诱导急性排斥反应的发生。第三部分IL-18在大鼠肾移植急性排斥反应中诱导iNOS和穿孔素的杀伤作用目的:通过比较动态观察IL-18、IFN-γ、iNOS和穿孔素在大鼠肾移植模型中移植肾mRNA表达和血中浓度变化,以及穿孔素在CD8+T淋巴细胞中的表达,探讨IL-18、IFN-γ、iNOS和穿孔素在大鼠肾移植急性排斥反应中对移植肾组织的损伤机制。方法:建立大鼠肾移植模型,将大鼠分为三组:同系移植组（Syn组）（SD-SD）（n=24）;急性排斥反应组（AR组）（Wistar-SD）（n=24）;CsA组:（Wistar-SD大鼠）（n=24）。于移植术后第1d、3d、5d、7d,每组处死受体鼠各6只,收集受体鼠的血液、移植肾和脾脏。分别采用ELISA和Real-time PCR检测血液中IL-18、IFN-γ、NO和穿孔素浓度和移植肾组织中IL-18、IFN-γ、iNOs和穿孔素mRNA表达。采用流式细胞仪检测穿孔素在CD8+T淋巴细胞的表达。同时切取部分移植肾组织作病检。结果:病理检查发现移植术后第5d和第7d,AR组病理变化较明显。大鼠肾移植术后第1d、3d、5d、7d,和同期的Syn组及CsA组比较,AR组IL-18、IFN-γ、和穿孔素在血中的浓度明显升高（P均<0.05）;术后第5d和7d,和同期的Syn组及CsA组比较,AR组NO在血中的浓度明显升高（P<0.01）;同时大鼠肾移植术后第1d、3d、5d、7d,和同期的Syn组及CsA组比较,AR组IL-18、IFN-γ和穿孔素在移植肾组织中的mRNA表达也明显升高（P均<0.05）,而术后第3d、5d、7d,和同期的Syn组及CsA组比较,AR组iNOS移植肾组织中的mRNA表达明显升高（P均<0.01）。在流式细胞检测中,穿孔素在CD8+T淋巴细胞中表达的阳性百分率在AR组最高。结论:在大鼠肾移植急性排斥反应中,IL-18可能通过巨噬细胞分泌的IFN-γ的产生,诱导iNOS对移植肾组织、细胞产生杀伤作用。同时通过CD8+T淋巴细胞上调穿孔素的表达造成移植肾组织的损伤。第四部分抗IL-18抗体在大鼠肾移植中诱导免疫耐受目的:通过在大鼠肾移植组中使用抗IL-18抗体,观察IL-18、IFN-γ、IL-10、iNOS和穿孔素在急性排斥反应期大鼠肾移植组中外周血mRNA表达变化及各组受体鼠的存活时间,探讨抗IL-18抗体在急性排斥反应的阻断及免疫耐受的诱导。方法:建立大鼠肾移植模型,将大鼠分为五组:同系移植组（Syn组）（SD-SD）（n=12）;急性排斥反应组（AR组）（Wistar-SD）（n=12）;CsA组:（Wistar-SD大鼠）（n=12）;抗IL-18组:（Wistar-SD大鼠）（n=12）;抗IL-18+CsA组:（Wistar-SD大鼠）（n=12）。观察各组平均生存时间。于移植术后第5d、7d、14d和20d尾静脉收集受体鼠外周血并检测BCr。采用Real-time PCR检测术后第5d和7d外周血IL-18、IFN-γ、IL-10、iNOS和穿孔素mRNA表达变化。结果:CsA组,抗IL-18组和CsA+抗IL-18组平均生存时间均大于AR组（P<0.01）,其中CsA+抗IL-18组平均生存时间均大于CsA组和抗IL-18组（P<0.01）。和其它组比较,术后第5及7d,IL-18、IFN-γ、iNOS和穿孔素mRNA表达在AR组最高（P<0.01）。术后第5及7d,和AR组比较,血清IL-18、IFN-γ、iNOS和穿孔素mRNA表达在CsA组,抗IL-18组和CsA+抗IL-18组较低（P<0.01）,其中以CsA+抗IL-18组下降最明显。相反,血清IL-10在CsA+抗IL-18组的mRNA表达最高（P<0.05）,而在AR组表达最低（P<0.05）。术后第5和7d,IL-10mRNA表达在CsA组和抗IL-18组均升高,但两组比较无差异（P>0.05）。结论:通过抗IL-18抗体对大鼠肾移植中IL-18的阻断可诱导免疫耐受的发生。其发生机制可能是通过下调IL-18 mRNA表达,降低IFN-γ的产生,诱导IL-10 mRNA的表达上调,促使Th1/Th2细胞因子平衡向Th2转移,诱导免疫耐受的发生。同时,通过下调iNOS和穿孔素mRNA的表达,减少移植肾组织的损伤。