SARS冠状病毒与H5N1型禽流感病毒致病机理的研究

论文摘要

近年来,由于哺乳动物细胞表达系统得到越来越广泛的应用,其优点是表达的蛋白质结构正确,且糖基化位点与天然蛋白相似。但哺乳动物细胞表达系统的一个最大瓶颈是产量较低。为了解决这一问题,本论文对几种重要蛋白质的编码序列进行了优化,并将编码序列连接到强表达载体上,转染哺乳动物细胞进行表达,发现所有蛋白质都能够正确表达,证实了序列优化方法的可行性。为了验证序列优化对蛋白表达水平的影响,我们比较了几种蛋白质的表达情况,发现经优化的序列蛋白质表达比未经优化的序列表达能力有明显的提高。而恒定表达细胞株的构建使持续获得高表达量的蛋白质成为可能。为了方便进行蛋白纯化,我们在载体上添加了CD5L引导肽序列,这可以增强蛋白的分泌能力,另外还添加了human Fc标签,可以方便的使用Protein A亲和层析柱进行蛋白富集与纯化。此外,为了能够得到不含标签的蛋白质,目的蛋白与Fc标签之间插入了TEV酶切位点。序列的优化、载体的改进及恒定表达细胞株的构建为获得高产量,高纯度的蛋白质奠定了基础。SARS-CoV进入细胞机制的研究导致严重急性呼吸综合征（SARS）世界性爆发流行的病原体是一种新型的冠状病毒:SARS冠状病毒（SARS-CoV）。SARS是一种以呼吸系统症状为主要表现的全身性疾病,可引起全身多器官多组织损伤,导致患者死亡的主要病因为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。其宿主范围广,传播速度快,且可通过飞沫传播,危害极大。关于这种致命病毒进入宿主细胞的方式,最早有学者通过电镜观察提出病毒通过直接膜融合方式进入细胞。而后来有病毒进入细胞依赖pH的报道,提示病毒进入细胞的方式可能并不是单一的。现有研究证实,SARS-CoV的刺突蛋白（Spikeprotein,S蛋白）是病毒表面最重要的膜蛋白,能够与受体结合并促进病毒入胞。本论文研究发现SARS-CoV可以通过内吞方式进入宿主细胞。SARS-CoV进入宿主细胞的过程中并不依赖于clathrin及caveolin蛋白;而脂筏,这种细胞表面重要的脂质微区在病毒进入细胞的过程中起重要作用。上述结果的阐明为了解SARS-CoV致病机理及研发新型抗病毒药物提供了重要信息。H5N1型禽流感病毒导致急性肺损伤机理的研究最近一段时间以来,不断发生H5N1型禽流感病毒感染禽类和人类的事件。由于这种病毒变异性极高,发生流行的危险较大。而且缺乏有效的预防与治疗方法,病人病死率非常高。因此,H5N1型禽流感病毒致病机理的研究显得尤为重要。病人主要的死亡原因为急性肺损伤,而关于急性肺损伤的分子机理,尚不清楚。本论文研究发现,H5N1型禽流感病毒可以通过以下两种方式导致急性肺损伤:1.H5N1通过诱导肺部巨噬细胞产生ROS,氧化细胞表面磷脂,激活TLR4-TRIF-NFkB通路导致大量炎性因子（IL-6）的产生,导致急性肺损伤。ROS抑制剂及氧化磷脂的清除剂都可以缓解H5N1导致的急性肺损伤。2.H5N1通过Akt-TSC2-mTOR通路诱导细胞产生自噬,并导致细胞死亡,进而导致急性肺损伤的发生。自噬的特异抑制剂及自噬特异分子的敲除可以缓解H5N1导致的急性肺损伤。上述结果的阐明为了解H5N1型禽流感病毒致病机理及研发新型抗病毒药物提供了重要信息。H5N1型禽流感病毒进入宿主细胞机制的研究关于禽流感病毒进入细胞机制的研究主要来自H1N1型病毒,由于不同病毒株进入不同细胞时采取的方式可能有所不同,而H5N1型禽流感病毒近期较为流行,我们研究了H5N1型禽流感病毒进入宿主细胞的方式。本论文发现H5N1型病毒进入人肺上皮细胞A549细胞时,依赖于clathrin蛋白而并不依赖于caveolin蛋白,这一结果的阐明为了解H5N1型禽流感病毒致病机理及研发新型抗病毒药物提供了重要信息。

论文目录

• 目录
• 图表目录
• 中文摘要
• Abstract
• 英文略语表
• 序言
• 第一部分 蛋白质编码序列优化及其在哺乳动物细胞中的高量表达与纯化
• 前言
• 1 实验材料
• 1.1 质粒
• 1.2 菌株
• 1.3 细胞株
• 1.4 工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker
• 1.5 主要化学试剂
• 1.6 细胞培养用耗材
• 1.7 试剂盒
• 1.8 主要仪器及设备
• 1.9 主要溶液配方
• 1.10 PCR引物
• 1.11 主要抗体
• 2 实验方法
• 2.1 序列优化
• 2.2 单链复性
• 2.3 PCR扩增
• 2.4 酶切消化
• 2.5 连接
• 2.6 转化
• 2.7 鉴定
• 2.8 感受态细胞的制备
• 2.9 质粒DNA的小提
• 2.10 质粒DNA的大量提取
• 2.11 重组质粒DNA浓度的测定
• 2.12 DNA的线性化及纯化回收
• 2.13 贴壁细胞培养
• 2.14 稳定表达细胞株的构建
• 2.15 细胞冻存
• 2.16 细胞复苏
• 2.17 细胞裂解
• 2.18 ELISA检测方法
• 2.19 Western Blotting检测方法
• 2.20 蛋白纯化
• 2.21 用流式细胞术检测表达蛋白的活性
• 3 实验结果
• 3.1 优化的编码基因
• 3.2 将合成片段插入载体,构建表达质粒
• 3.3 瞬时转染细胞,检测蛋白的表达
• 3.4 序列优化增加蛋白表达
• 3.5 PCR去掉跨膜区以促进蛋白向胞外分泌
• 3.6 无跨膜区质粒表达检测
• 3.7 质粒大提
• 3.8 构建稳定表达细胞株
• 3.9 检测融合蛋白的正确表达,并测定表达量
• 3.10 蛋白纯化
• 3.11 融合蛋白H5ΔTM-Fc的活性检测
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 SARS-CoV进入细胞机制的研究
• 前言
• 1.实验材料
• 1.1 质粒
• 1.2 菌株
• 1.3 细胞株
• 1.4 主要试剂与抗体
• 1.5 主要仪器设备
• 1.6 主要溶液配方
• 2.实验方法
• 2.1 293E-ACE2-GFP细胞株的构建
• 2.2 SARS-CoV刺突蛋白S1190-Fc及对照Fc蛋白的制备
• 2.3 假病毒包装与感染
• 2.4 刺突蛋白或假病毒诱导ACE2-GFP蛋白转位
• 2.5 免疫荧光
• 2.6 抑制剂对SARS假病毒进入细胞的影响
• 2.7 SiRNA实验
• 2.8 Transferrin及CTB摄取实验
• 3 实验结果
• 3.1 293E-ACE2-GFP细胞株的构建
• 3.2 S1190-Fc及Fc蛋白的制备
• 3.3 SARS假病毒的包装
• 3.4 Spike蛋白诱导ACE2-GFP蛋白向细胞内转位
• 3.5 Spike蛋白被内吞进入细胞
• 3.6 受体的循环与阻断
• 3.7 SARS假病毒诱导ACE2-GFP蛋白向细胞内转位
• 3.8 受体的循环与阻断
• 3.9 SARS假病毒绿色荧光蛋白表达时间谱
• 3.10 SARS假病毒进入Vero E6细胞的过程依赖于pH
• 3.11 SARS假病毒与早期内体Marker EEA1共定位
• 3.12 CPZ不能抑制SARS假病毒进入Vero E6细胞
• 3.13 CHC siRNA不能抑制SARS假病毒进入宿主细胞
• 3.14 显性负EPS15质粒不能抑制SARS假病毒进入Vero E6细胞
• 3.15 MβCD,Nystatin及filipin可以有效的抑制Vero E6细胞对CTB的摄取
• 3.16 MβCD可以有效的抑制SARS假病毒进入Vero E6细胞
• 3.17 SARS假病毒进入Vero E6细胞的过程不依赖于caveolin-1
• 3.18 细胞松弛素D（cytochalasin D）可以抑制SARS假病毒进入细胞
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 H5N1 型禽流感病毒导致急性肺损伤机理的研究
• 前言
• 1.实验材料
• 1.1 质粒
• 1.2 菌株
• 1.3 细胞株
• 1.4 实验动物
• 1.5 病毒株
• 1.6 主要生化试剂和抗体
• 1.7 细胞培养试剂
• 1.8 SiRNA
• 1.9 主要仪器及设备
• 1.10 主要溶液配制
• 2.实验方法
• 2.1 H5N1型禽流感病毒的表面膜蛋白H5蛋白的制备
• 2.2 人外周血单核细胞的分离
• 2.3 用流式细胞仪检测H5蛋白或灭活H5N1病毒诱导人外周血单核细胞产生ROS
• 2.4 用共聚焦显微镜检测H5蛋白或灭活H5N1病毒诱导人外周血单核细胞TLR4受体向细胞表面聚集
• 2.5 用流式细胞仪检测H5蛋白或灭活H5N1病毒诱导人外周血单核细胞TLR4受体向细胞表面聚集
• 2.6 电镜观察灭活的H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺组织产生autophagy
• 2.7 电镜观察H5N1型禽流感病毒诱导细胞产生autophagy
• 2.8 用共聚焦显微镜观察灭活H5N1型禽流感病毒诱导细胞LC3的凝集变化
• 2.9 用Western Blot检测灭活H5N1型禽病毒感染A549细胞后蛋白表达水平的变化
• 2.10 细胞活力实验
• 2.11 细胞水平siRNA实验
• 2.12 灭活H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺损伤的病理检查
• 2.13 灭活H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺弹性的检测
• 2.14 H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺水肿及3MA的预防作用
• 2.15 H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺水肿及3MA的治疗作用
• 2.16 H5N1型禽流感病毒诱导小鼠死亡率检测及3MA的预防作用
• 2.17 H5N1型禽流感病毒诱导小鼠死亡率检测及3MA的治疗作用
• 2.18 小鼠肺组织Atg5 siRNA敲除实验
• 3.实验结果-1:H5N1通过产生ROS诱导急性肺损伤发生
• 3.1 重组H5蛋白的制备
• 3.2 H5蛋白诱导人外周血单核细胞产生ROS
• 3.3 灭活的H5N1禽流感病毒诱导人外周血单核细胞产生ROS
• 3.4 Confocal检测H5蛋白引起人外周血单核细胞TLR4向细胞表面聚集
• 3.5 Confocal检测灭活的H5N1禽流感病毒引起人外周血单核细胞TLR4向细胞表面聚集
• 3.6 流式细胞术检测H5蛋白引起人外周血单核细胞TLR4向细胞表面聚集
• 3.7 流式细胞术检测灭活的H5N1禽流感病毒引起人外周血单核细胞TLR4向细胞表面聚集
• 3.8 灭活H5N1处理的小鼠肺组织中有氧化磷脂（OxPLs）产生
• 3.9 TLR4基因敲除小鼠及TRIF基因敲除小鼠肺损伤程度明显改善
• 3.10 H5N1诱导的肺损伤与IL-6的产生相关
• 3.11 H5N1通过ROS激活TLR4-TRIF-NFkB通路诱发急性肺损伤
• 4.实验结果-2:H5N1通过诱导细胞发生自噬导致急性肺损伤
• 4.1 H5N1诱导小鼠肺泡上皮细胞发生自噬
• 4.2 H5N1病毒诱导A549细胞发生自噬
• 4.3 H5N1诱导LC3凝集
• 4.4 H5N1诱导LC3 Ⅱ表达上调
• 4.5 H5N1通过诱导自噬导致A549细胞死亡
• 4.6 Atg12 siRNA可以缓解H5N1导致的细胞死亡
• 4.7 H5N1引起mTOR磷酸化水平下调
• 4.8 TSC2敲除后细胞发生自噬减少
• 4.9 TSC2敲除后细胞生存力升高
• 4.10 H5N1引起Akt磷酸化水平下调
• 4.11 H5N1病毒导致细胞自噬通路图
• 4.12 H5N1病毒处理小鼠引起小鼠肺损伤的病理结果
• 4.13 3MA可以抑制H5N1诱导的LC3 Ⅱ的升高
• 4.14 3MA可以改善灭活H5N1病毒处理小鼠的肺弹性
• 4.15 3MA作为预防性药物可以减缓H5N1导致的肺水肿程度
• 4.16 3MA作为预防性药物可以降低H5N1导致的小鼠死亡率
• 4.17 3MA作为治疗性药物可以减缓H5N1导致的肺水肿程度
• 4.18 3MA作为治疗性药物可以降低H5N1导致的小鼠死亡率
• 4.19 Atg5 siRNA可以改善灭活H5N1病毒处理小鼠的肺弹性
• 4.20 Atg5 siRNA可以减缓H5N1导致的肺水肿程度
• 4.21 Atg5 siRNA可以降低H5N1导致的小鼠死亡率
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 H5N1型禽流感病毒进入A549细胞机制的研究
• 前言
• 1.实验材料
• 1.1 细胞株
• 1.2 病毒株
• 1.3 主要试剂与抗体
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 SiRNA
• 1.6 主要溶液配方
• 2 实验方法
• 2.1 MTT实验
• 2.2 抑制剂对细胞活力的影响
• 2.3 SiRNA实验
• 2.4 CTB摄取实验
• 3 实验结果
• 3.1 灭活H5N1病毒造成的A549细胞死亡具有剂量依赖效应
• 3.2 灭活H5N1病毒造成的A549细胞死亡具有时间依赖特性
• 3.3 氯喹可以缓解H5N1造成的细胞死亡
• 3.4 Bafilomycin A1可以缓解H5N1造成的细胞死亡
• 3.5 CPZ可以缓解H5N1造成的细胞死亡
• 3.6 CHC siRNA可以缓解H5N1造成的细胞死亡
• 3.7 Clathrin siRNA可以有效的将clathrin HC敲除
• 3.8 MβCD,Nystatin和filipin可以有效的抑制细胞对CTB的摄取
• 3.9 MβCD不能缓解H5N1造成的细胞死亡
• 3.10 Nystatin不能缓解H5N1造成的细胞死亡
• 3.11 Filipin不能缓解H5N1造成的细胞死亡
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述1-Molecular pathogenesis of severe acute respiratory syndrome
• 综述2-Avian Influenza H5N1:An Update on Molecular Pathogenesis
• 致谢
• 个人简历