论文题目: 载脂蛋白A-Ⅰ在机体急性相反应中对中性粒细胞功能的调节作用研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 廖雪玲
导师: 吴满平,楼滨
关键词: 高密度脂蛋白,载脂蛋白,急性相反应,内毒素,中性粒细胞,超离心,分子筛色谱,离子交换色谱,凝胶扫描图象分析,白细胞趋化寡肽,佛波酯,粘附,脱颗粒,呼吸爆发,细胞杀伤
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本实验的研究内容主要包括两个方面:一、研究血浆高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein,HDL）在内毒素（endotoxin）诱导的急性相反应（acute phaseresponse,APR）中其组分的改变:二、重点研究载脂蛋白A-Ⅰ（apolipoprotein A-Ⅰ,apoA-Ⅰ）对趋化寡肽（N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,f-MLP）以及佛波酯（phorbol myristate acetate,PMA）激活的中性粒细胞（polymorphonuclearleukocyte,PMN）功能的影响。 本实验采用革兰氏阴性菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）在家兔体内诱导APR作为研究对象,观察APR发展过程中兔血浆HDL的改变,尤其是apoA-Ⅰ的变化,为APR过程中apoA-Ⅰ由HDL颗粒中释放出来并发挥免疫调节作用的可能性提供实验基础。 雄性新西兰兔,2.2～2.5kg,静脉注射LPS1.0mg/kg诱导APR,于APR不同时相采集血样:①超离心制备兔血浆HDL（d=1.063～1.21g/mL）,以分子筛色谱分析其分子大小的改变,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE）,凝胶图像分析以及ELISA等实验手段分析其蛋白成分的变化;②8%PEG-6000化学沉淀法分离血浆HDL,测定胆固醇和三酰甘油含量的变化。 超离心制备的兔血浆HDL经过乙醇/乙醚法脱脂得到HDL载脂蛋白（apolipoproteins of HDL,apoHDL）,apoHDL经高效灌注色谱仪阴离子交换树脂分离apoHDL各组分,收集各组分峰,超滤离心脱盐浓缩后以SDS-PAGE鉴定各峰蛋白成分,收集纯apoA-Ⅰ,用于PMN功能研究。 肝素抗凝无菌新鲜兔血,采用梯度离心法分离纯化PMN:PBS稀释（1:1）的兔抗凝全血小心添加至淋巴细胞分离液（d=1.077g/mL）上层（v/v,1:1）,室温,400×g,离心20min。富含粒细胞和红细胞的下层（d>1.077g/mL）与等体积2.5%（w/v）优质明胶溶液（经高压高热灭菌）混匀,冰上沉降30min,除去大部分红细胞,粒细胞中混杂的少量红细胞以Gey’s液去除。收集制备的粒细胞,经台盼蓝染色和吉姆萨染色证实细胞存活率>95%,PMN含量>95%。 以终浓度为10-7mol/L的fMLP和PMA作为PMN受体途径及非受体途径激
论文目录:
摘要
ABSTRACT
前言
材料与仪器
实验方法
一、兔血浆HDL制备
二、家兔APR的诱导
三、家兔APR不同时相血浆的琼脂糖电泳
四、超离心制备家兔APR不同时相血浆HDL的分子筛色谱
五、离子交换色谱法制备apoA-Ⅰ
六、HDL抗血清(小鼠抗兔)制备
七、ELISA测定apoHDL
八、APR不同时相血浆HDL的SDS-PAGE及凝胶图象分析
九、脂质测定
十、PMN的分离
十一、apoA-Ⅰ与PMN的结合
十二、apoA-Ⅰ对PMN功能的影响
(一) PMN功能实验实验组的设置
(二) apoA-Ⅰ对PMN粘附功能的影响
(三) apoA-Ⅰ对PMN呼吸爆发功能的影响
(四) apoA-Ⅰ对PMN脱颗粒功能的影响
(五) apoA-Ⅰ对fMLP／PMA激活的PMN的细胞毒性的影响
十三、统计学分析
实验结果
一、兔血浆HDL制备
二、LPS诱导家兔APR不同时相血浆HDL组成成分的改变
(一) 家兔APR不同时相血浆的琼脂糖电泳
(二) 超离心制备兔APR不同时相血浆HDL的分子筛色谱比较
(三) 超离心制备兔APR-0h-HDL及APR-3h-HDL的分子筛色谱及各色谱峰的成分鉴定
(四) APR不同时相HDL(超离心制备)SDS-PAGE及其图象分析
(五) ELISA方法建立以及APR不同时相apoHDL的测定
(六) HDL胆固醇及三酰甘油含量测定
三、离子交换色谱制备apoA-Ⅰ
四、apoA-Ⅰ与PMN的结合
(一) ELISA法测定apoA-Ⅰ与PMN的结合
(二) FITC-apoAI与PMN的结合
五、apoA-Ⅰ对PMN功能的影响
(一) apoA-Ⅰ对PMN粘附功能的影响
(二) apoA-Ⅰ对PMN呼吸爆发功能的影响
(三) apoA-Ⅰ对PMN脱颗粒功能的影响
(四) apoA-Ⅰ对fMLP/PMA激活的PMN的细胞毒性的影响
实验讨论
结论
研究方向
参考文献
致谢
附录1：综述
附录2：实验用溶液
论文独创性声明
发布时间: 2005-09-19
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