视网膜变性疾病中内层神经细胞的变构研究

论文摘要

研究背景视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）是一类以光感受器细胞进行性功能障碍为特征,最终导致视觉障碍的一组进行性遗传性营养不良性退行病变,是世界范围内常见的致盲性眼病。临床特点主要为进行性视野缺失、夜盲、色素性视网膜病变和视网膜电图异常。RP好发于少年和青壮年,患者在青壮年时期出现双眼视力进行性下降最终视力完全丧失,对患者和社会带来极重的负担。在中国,每年因视网膜变性疾病失明的患者近100万,在白内障、角膜病、玻璃体疾病等致盲性眼病已有完备的治疗方案之后,目前还没有阻止RP病变进展和恢复视网膜功能的有效治疗方法。尽管在过去的数十年间,人们对该病的治疗进行了各种尝试,包括视网膜移植、基因治疗、视觉假体、药物干预等,但至今尚无确切有效、能重建视功能的治疗方法。究其根本原因在于视网膜变性的病理机制极为复杂,在感光细胞丧失之后内层神经元也发生继发变性,因此视功能的维持和重建存在巨大的障碍。那么,光感受器细胞的丢失对视网膜内层神经细胞究竟产生了什么样的影响,至今尚不完全清楚,本课题针对视网膜色素变性疾病中的内层神经细胞结构和功能的变构进行探究。研究中,我们采用皇家外科学院大鼠（Royal College of Surgeons rat, RCS）,这是一种遗传性视网膜色素变性的经典动物模型,该鼠的感光细胞进行性变性。既往发现随着变性的发展,视网膜整体电位水平下降,甚至呈熄灭状态,进一步的研究发现,视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell, RGCs）的功能也受到严重影响,部分RGCs甚至不能产生动作电位的发放。那么,在视网膜变性中继发感光细胞丧失之后,内层的RGCs的密度分布、形态结构发生了什么样的改变,以及钙离子的流向在其中起了什么样的作用,都有待深入探讨。此外另有研究表明在视网膜中存在一种非视觉图像感光系统,此系统由特殊的视网膜神经节细胞直接进行感光,此类细胞含有特殊的感光色素melanopsin,称之为感光神经节细胞（Melanopsin-containing retinal ganglion cells, mRGCs）,在缺乏视杆和视锥细胞的条件下仍对光线敏感,并且将非图像视觉信号传送到下丘脑的视交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）,参与生物节律的形成和瞳孔光反射等。这类细胞仅占神经节细胞层细胞的1%-2%,广泛分布于整个视网膜,构成独立的感光网络。那么,在变性条件下,作为同样位于视网膜内层的神经元,mRGCs的分布、细胞的形态、突起分支构架以及分层,与周围视网膜神经细胞的联系,究竟发生了什么样的改变还不清楚。目前,关于视网膜色素变性过程中各级神经元之间突触结构和功能“重构”（remodeling）的机制已成为视网膜色素变性的病理机制研究中的热点问题。有研究表明视网膜色素细胞、视杆细胞由于基因缺陷,或视网膜发生变性、损伤时,无功能输入的视网膜神经层会启动一个“重构”（remodeling）反应。其特点为,上级神经元发出轴索,其末梢形成微神经瘤或异常突触,造成视网膜回路重新连接；神经元表面的分子表型丧失或被修改；muller细胞向外迁徙并形成视网膜下间隙纤维化,使残存的视网膜无法从色素细胞和脉络膜获得营养因子和生存支持,光感受器细胞和神经元逐渐死亡。那么mRGCs是否参与了重构,它的这种改变,对于视网膜变性中视网膜神经细胞的保留、视觉功能的重建有什么样的提示。为此,本研究拟采用视网膜变性RCS大鼠,通过荧光金（Fluorogold）逆行标记RGCs、抗nelanopsin抗体免疫荧光标记mRGCs,激光共聚焦显微镜观察神经节细胞钙离子成像及感光神经节细胞神经网络重构的变化,初步探讨视网膜内层神经细胞继发感光细胞变性死亡的可能机制。目的研究RCS大鼠视网膜变性过程中神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）分布、密度、细胞形态,以及细胞内钙浓度的变化,探讨视网膜变性对RGCs的影响以及可能的触发因素。方法采用视网膜变性RCS大鼠和正常对照大鼠,分为变性组和对照组。按生后21天（P21d）、60天（P60d）以及90天（P90d）分3个时间段,每时间点各6只大鼠,采用立体定位下行RCS大鼠上丘和外膝体Fluorogold逆行标记RGCs,荧光显微镜下行视网膜铺片观察,研究RGCs在视网膜变性中的分布、形态和突起变化,以及密度改变。以及采用fluo-4AM孵育活体状态下的视网膜铺片和切片,行激光共聚焦观察RGCs胞内钙成像,分析RGCs在变性过程中胞内钙浓度的变化。结果荧光标记的RGCs分布于整个视网膜,沿神经纤维走形分布,细胞胞体和突起清晰可见。RCS大鼠变性晚期RGCs胞体大小不一,细胞分布较稀疏,细胞突起分枝数和范围减小,RCS大鼠RGCs密度P21d时为5400+109/mm2,P60d时4167+134/mm2,P90d时2807+161/mm2,随着变性发展神经节细胞的数量显著减少（F=536.463,P=0.000）,与同组的Control大鼠统计学比较差异非常显著（t60=24.172,t90=30.131,P=0.000）,P60d时RCS大鼠存活的RGCs占同期Control大鼠的约80%,P90d时约占58%。变性晚期RCS大鼠视网膜神经节细胞胞内钙呈高强表达,表现为钙超载现象,P60d、P90d时变性RCS大鼠神经节细胞胞内钙强度分别为335.0+20.8U/mrn2和420.2+43.0U/mm2与对照大鼠相比差异非常显著（t60=-18.058,t90=-15.015,P=0.000）,同时钙荧光不仅表达在RGCs的胞体,也表达在树突上,向内丛状层延伸。结论变性晚期RCS大鼠RGCs继发感光细胞的丧失也发生变性死亡,细胞形态和分布密度受到显著影响,RGCs胞内钙浓度的变化可能是神经节细胞变性、死亡的触发因素：RCS大鼠变性晚期RGCs由于胞内钙的增加,激活一系列级联反应,最终引起胞膜上受体和通道的改变,最终使得RGCs功能失活甚至变性死亡。因此我们推测,视网膜变性中RGCs胞内钙浓度的变化是神经节细胞变性、死亡的可能触发因素。目的含]melanopsin的视网膜神经节细胞可直接感光,并调制生物节律和瞳孔光反射等,探讨此种特殊的感光细胞即感光神经节细胞mRGCs,在视网膜变性疾病中的结构改变和周围视网膜神经网络的变构。方法采用经典的视网膜变性动物模型RCS大鼠,及正常大鼠,分为变性组和对照组。按生后21天（P21d）、60天（P60d）以及90天（P90d）分3个时间段,每时间点各6只大鼠,实验中行抗melanopsin免疫荧光染色,视网膜铺片,激光共聚焦显微镜观察,计算机分析nRGCs勺胞体形态、视网膜内的分布、突起分支形态和分层。结果随着感光细胞的丢失,RGCs也显著减少,而mRGCs却得以保留。视网膜变性RCS大鼠mRGCs的胞体形态、分布范围和数量和正常对照大鼠相似。视网膜变性RCS大鼠神经节细胞层的感光神经节细胞密度,P21d时148+10/mm2,P60d时135±8/mm2,P90d时136+17/mm2,不同阶段差异无统计学意义（F=1.892,P=0.185）。而变性后期（P60d和P90d）mRGCs突起上melanopsin的表达明显增强,树突的网络变密集,树突分支明显增多,树突野范围增大。结论随着视网膜变性中感光细胞的丢失,mRGCs以乎更能耐受变性而更能得以保留,此外,mRGCs与周围视网膜神经细胞之间的网络连接提示内层神经视网膜在变性中发生了结构的重建。提示在视网膜变性后视皮层神经元保留了一定的突触可塑性,以挽救视力的丧失。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 视网膜色素变性疾病中RGCs形态改变及钙流的变化
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 统计方法
• 1.4 结果
• 1.5 讨论
• 1.6 小结
• 第二章 视网膜色素变性疾病中mRGCs及周围神经网络的变构
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 统计方法
• 2.4 结果
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 总结
• 参考文献
• 综述 感光神经节细胞与人类疾病的关系
• 参考文献
• 成果
• 致谢
• 附件