Mab21L2基因在人晶状体上皮细胞分化中的功能分析

论文摘要

以前的研究表明Mab21L2在眼睛尤其是晶状体发育过程中起重要作用[1,2],但是Mab21L2调控晶状体发育的分子机制目前尚不清楚.体外培养的晶状体上皮细胞,被广泛运用为研究晶状体发育和分化的模型。HLE细胞系是向体外培养的人晶状体上皮细胞中转入SV40大T抗原而得到的转化细胞系,我们利用这一细胞系研究Mab21L2在晶状体分化中的可能功能。纯化的Mab21L2表达质粒和它的载体被分别转入HLE细胞中,用400μg/ml的G418筛选获得稳定的克隆,然后用RT-PCR和Western Blot鉴定高表达Mab21L2的克隆。形态观察发现,高表达Mab21L2的克隆与载体转染的克隆相比,细胞形态有明显变化,细胞变长,有明显纤维化表型。为了进一步探索Mab21L2在晶状体分化中的功能,我们用75ng/ml和100ng/ml的FGF-basic处理Mab21L2和载体转染的稳定高表达克隆,在同样的浓度处理时,高表达Mab21L2的克隆大概只需2-3天,纤维化已经十分明显,但是转入了载体的对照克隆却需要5天才出现较明显纤维化,很明显过表达Mab21L2可以加速FGF-basic诱导的HLE细胞分化。FGF-basic处理细胞后,提取细胞总蛋白,Western Blot检测结果表明Mab21L2和载体转染的克隆中,pERK1/2的表达模式十分不同。在没有FGF-basic处理时,高表达Mab21L2的克隆中pERK1/2的表达被抑制,明显低于对照克隆中pERK1/2的表达；但是当用FGF-basic处理细胞1或2天后,高表达Mab21L2的克隆中pERK1/2的表达极大的增强,因而远高于对照克隆中的pERK1/2;但到处理4天后,高表达Mab21L2的克隆中pERK1/2表达急剧下降,又一次低于对照克隆中pERK1/2的表达。此外,表达系和对照系中,PP2A调节亚基B56γ和MEK2的表达模式也有明显差异,并且MEK2与pERK1/2的表达水平正相关,B56γ与pERK1/2的表达水平负相关。这些结果提示Mab21L2促进HLE细胞分化的分子机制是通过调节B56γ和MEK2的表达,从磷酸化和去磷酸化两方面,精确调控pERK1/2表达水平来实现的。在FGF-basic诱导HLE分化的不同阶段,Mab21L2既可正性也可负性调节pERK1/2表达水平。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 MAB-21基因简述
• 1.2 晶状体概述
• 1.2.1 晶状体的结构和功能
• 1.2.2 晶状体发育和分化
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 RT-PCR
• 2.2.2 Western Blot
• 2.2.3 质粒准备
• 2.2.4 转染及高表达克隆的筛选
• 2.2.5 细胞培养
• 2.2.6 FGF-basic处理细胞
• 第三章 实验结果与讨论
• 3.1 实验结果
• 3.1.1 RT-PCR和Western blot鉴定高表达克隆
• 3.1.2 高表达Mab21L2的克隆形态形态上有纤维化趋势
• 3.1.3 Western blot检测过表达系和对照系中差异表达蛋白
• 3.1.4 FGF-absic处理后细胞形态观察
• 3.1.5 FGF-basic处理后对照系和过表达系蛋白的差异表达模式
• 3.2 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢