论文摘要
目的：骨肉瘤是临床常见的原发性骨恶性肿瘤之一,约占所有骨肿瘤的20%,多见于青少年,恶性程度高,易复发和转移,预后较差。Livin是近年来发现的人凋亡抑制蛋白家族的新成员,某些实体肿瘤组织中存在特异性的表达,能抑制多种凋亡刺激因素所诱发的细胞凋亡。胎盘生长因子（Placental growth factor, PIGF）是属于VEGF家族的糖蛋白,在肿瘤等病理性血管生成和调控中发挥着极为重要的作用。PIGF作为调节新生血管生成的相关因子在骨肉瘤中表达状况的研究目前尚无报道。本实验的第一部分主要研究Livin及PIGF蛋白在骨肉瘤组织和正常骨组织中的表达差异以及该两种蛋白在骨肉瘤组织中阳性表达之间的相关性,分析两者在骨肉瘤的临床诊断及治疗中的意义。该部分研究的另一目的是研究Livin及PlGF mRNA在骨肉瘤MG-63、Saos-2以及U2-OS细胞株中的表达差异,分析其与细胞分化成熟程度之间的关系；第二部分主要研究制备葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米基因载体,并对其生化特性、粒径、形态等相关性质进行表征。研究该纳米基因载体对骨肉瘤MG-63和Saos-2细胞增殖的抑制作用；第三部分研究构建Livin-shRNA的真核表达载体,获得Livin-shRNA质粒稳定转染的骨肉瘤MG-63细胞,应用上述实验制备的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米基因载体将阿霉素和Livin-shRNA质粒同时转入骨肉瘤MG-63和Saos-2细胞中并优化转染效率,研究该纳米载体介导的化疗联合基因治疗在骨肉瘤中的综合作用。为进一步研究纳米载体、基因治疗以及综合治疗在骨肉瘤中的作用机制进行探索。方法：第一部分：研究Livin及PIGF在骨肉瘤组织和不同骨肉瘤细胞株中的表达差异以及该两种因子在骨肉瘤中阳性表达的相关性,分析两者在骨肉瘤的临床诊断及治疗中的意义；选取我院骨科在2003年至2008年之间行活检或手术切除的57例骨肉瘤组织标本和10例正常骨组织标本。应用免疫组织化学染色法检测Livin和PIGF蛋白在骨肉瘤组织和正常骨组织标本中的表达,根据阳性细胞百分比和染色强弱综合判断两种蛋白的表达水平,并分析两者阳性表达之间的相关性及与骨肉瘤各项临床病理指标之间的相关性。应用Real-time PCR检测Livin和PIGF mRNA在骨肉瘤MG-63细胞、Saos-2细胞及U2-OS细胞中的表达,研究其在不同细胞株中的表达差异。第二部分：制备葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米基因载体并对其进行表征。通过两步法合成葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米基因载体,优化制备条件。首先,由于高碘酸钠引发的氧化反应,葡聚糖T40被氧化产生醛基。盐酸羟胺滴定法测定氧化葡聚糖的氧化程度和醛基含量,红外光谱及紫外光谱分析对氧化葡聚糖的结构进行表征,水相凝胶渗透色谱仪测定氧化葡聚糖的分子量。其次,阿霉素及聚乙烯亚胺分子中的游离氨基通过雪夫式碱（Skiff base）的形式结合到氧化葡聚糖的醛基上,应用硼氢化钠促使该反应产物形成稳定的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米基因载体。采用紫外分光光度法测定该纳米基因载体中偶合阿霉素的含量和载药率。应用紫外光谱、红外光谱以及核磁共振分析对其结构进行表征,应用透射电镜观察该纳米载体的形态及大小,应用马尔文激光粒度仪测定纳米载体的粒径和表面电位。利用该纳米载体上的氨基与DNA的磷酸根基团通过静电吸附作用形成稳定的纳米基因复合物,应用透射电镜观察其形态和大小,1%琼脂糖凝胶电泳检测该纳米基因载体对DNA的缩合能力,激光粒度仪测定其粒径和表面电位。MTT细胞毒性实验分别测定阿霉素、葡聚糖-聚乙烯亚胺共聚物以及葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米载体对骨肉瘤MG-63和Saos-2细胞的增殖抑制作用。第三部分：研究葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米载体介导的化疗联合基因治疗在骨肉瘤中的综合作用。合成Livin基因干扰序列并定向插入到RNA干扰（RNAi）真核表达载体pGenesil-1质粒,通过测序进行鉴定。干扰质粒经脂质体Lipofectamine2000介导转染骨肉瘤MG-63细胞,经G-418持续筛选获得稳定转染Livin shRNA的细胞系。Real-timePCR和Western blot分别检测稳定转染细胞中Livin mRNA和蛋白的表达,验证Livin-shRNA真核表达质粒在骨肉瘤MG-63细胞中对Livin的基因沉默效果。应用上述实验制备的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米基因将Livin shRNA质粒转入骨肉瘤MG-63和Saos-2细胞中并优化转染条件（以携带相同Livin shRNA质粒的脂质体载体以及PEI25K载体为阳性对照）。倒置荧光显微镜观察转染前后骨肉瘤细胞的形态学改变以及转染后绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术测定该纳米载体对Livin shRNA表达质粒的转染效率,并分析其与脂质体Lipofectamine 2000以及PEI 25K的转染效率之间的差异。MTT细胞毒性实验检测该纳米载体介导的阿霉素和Livin基因的下调对骨肉瘤细胞增殖的联合抑制作用。结果：第一部分：Livin及PIGF表达主要定位于骨肉瘤细胞的细胞质,少数位于细胞核,为棕黄色颗粒。57例骨肉瘤组织中Livin及PIGF阳性表达数为分别为30例（52.6%）和37例（64.9%）,该两种蛋白在10例正常骨组织中均无阳性表达。两者在骨肉瘤组织中的表达显著高于正常骨组织（P<0.05）。Livin与PIGF mRNA在三种骨肉瘤（MG-63、Saos-2、U2-OS）细胞中均呈现表达。Real-time PCR结果显示Livin基因在MG-63细胞中的表达明显高于在Saos-2和U2-OS细胞中的表达,分别是后者的1.59和2.39倍。PIGF mRNA在MG-63细胞中的表达分别是U2-OS细胞的8.57倍和Saos-2细胞的3.49倍。Livin及PIGF的阳性表达在不同年龄、性别、肿瘤部位及病理学分型分组之间的差异无统计学意义。而在不同骨肉瘤Enneking临床分期、肿瘤大小分组之间的差异具有统计学意义。在肿瘤直径≤5cm的38例标本中,Livin的阳性表达率为42.1%,>5cm的19例标本中为73.7%,两组之间的差异具有统计学意义（P=0.002）。而PIGF在肿瘤≤5cm与＞5cm的两组之间的阳性表达率分别为52.6%和89.5%,差异具有统计学意义（P=0.013）。PIGF在ⅠB～ⅡA期骨肉瘤中的阳性表达率仅为40.0%,ⅡB～Ⅲ期为78.4%,两组之间的差异具有统计学意义（P=0.008）。ⅠB-ⅡA期骨肉瘤中,Livin的阳性表达率为30%,但在ⅡB～Ⅲ期中为64.9%,两组之间的表达差异具有统计学意义（P<0.01）。30例Livin蛋白表达阳性的骨肉瘤组织,PIGF蛋白表达阳性者为22例,在Livin阴性表达的26例标本中PIGF有6例阴性表达。在骨肉瘤中,Livin的阳性表达与P1GF的阳性表达之间不具有相关性（P=0.642）。第二部分：紫外光谱及红外光谱表征结果表明氧化葡聚糖分子中出现了葡聚糖分子本身不具有的醛基结构。盐酸羟胺滴定实验表明氧化葡聚糖的醛基含量与投入反应的高碘酸钠的质量成正比,水相凝胶渗透色谱分析结果表明随着氧化程度的增加,氧化葡聚糖的分子量相应减少。当投入反应的高碘酸钠与葡聚糖质量比为2时,所形成的氧化葡聚糖的醛基含量是15.8mmol/L,而此时其分子量由40000减少到13000左右。葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米载体分别在490 nm处出现阿霉素的特征性紫外吸收峰以及在核磁共振图谱的3.9-4.0 ppm和2.5-3.2 ppm处分别出现了阿霉素和聚乙烯亚胺的特征峰。激光粒度仪测定该纳米载体的粒径和Zeta电位分别为225±47 nm和+33.84±4.1 mV。上述表征结果均表明阿霉素和聚乙烯亚胺已被成功偶合到氧化葡聚糖分子上。紫外分光光度法测定该纳米载体中阿霉素的偶合率为17.43±0.548%,并且在双蒸水溶液中较稳定,以双蒸水为介质透析4天后游离阿霉素的浓度由0.0107±0.005 mg/L减少至0.0023±0.005 mg/L。透射电镜结果显示该纳米粒为近似圆形,分散性较好。纳米载体与DNA以不同的N/P比混合后所形成复合物的粒径随N/P比的增加呈现减小的趋势,Zeta电位却呈现相反的趋势。当N/P为4时,纳米基因复合物的粒径减少到166±22 nm, Zeta电位则为+14.47±4.1 mV。而N/P进一步增大到20,纳米基因复合物的粒径也随之减小到146±23 nm,此时的Zeta电位则增加到为+24.71±5.3 mV。MTT细胞毒性实验表明给药24小时后,阿霉素对MG-63和Saos-2细胞的增殖抑制作用均低于同浓度的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米载体,但两组之间的差异不具有统计学意义（P>0.05）。而给药48小时后纳米载体的细胞抑制作用则明显高于游离阿霉素（P<0.05）。而单纯葡聚糖-聚乙烯亚胺共聚物在不同时间点对两种骨肉瘤细胞的增殖抑制作用明显低于游离阿霉素和葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米载体,差异具有统计学意义（P<0.05）。第三部分：测序结果表明,所获得的重组干扰质粒目的片段与预期完全相符,表明退火形成的干扰寡核苷酸成功连接入pGenesil-1载体。干扰质粒转染的MG-63细胞在倒置荧光显微镜下呈明亮绿色荧光,表明细胞中有转染的外源基因表达。Real-time PCR结果表明Livin shRNA质粒有抑制MG-63细胞中Livin基因表达的作用,干扰作用达72%；转染Livin shRNA质粒后的细胞中Livin基因表达水平明显低于空白对照组、非特异性转染组,（P<0.05）。而空白对照组、非特异性转染组相比,Livin基因表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。转染后Livin蛋白显色可见,特异性Livin shRNA质粒转染组的Livin蛋白染色条带减弱,Livin shRNA有抑制Livin蛋白表达的作用,干扰作用达69%。特异性转染Livin shRNA组的Livin蛋白表达水平明显低于空白对照组、非特异性转染组（P<0.05）。而空白对照组、非特异性转染组相比,Livin蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。Westem blot结果与Real-time PCR结果一致。倒置荧光显微镜以及流式细胞术均表明葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米载体能有效地将Livin shRNA表达质粒转入骨肉瘤细胞中,其在MG-63和Saos-2细胞中的转染效率分别是18.6±0.40%和15.3±0.50%。转染效率与PEI 25K相似但稍低于Lipofectamine 2000的转染效率。MTT细胞毒性实验结果表明在转染早期,纳米载体介导的Livin shRNA质粒转染+阿霉素对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用与游离阿霉素组及纳米基因载体组相似,但给药72小时后纳米载体介导Livin shRNA质粒转染+阿霉素组的骨肉瘤细胞存活率明显低于游离阿霉素组和纳米基因载体组（P<0.05）。其中纳米基因载体组对骨肉瘤细胞的增殖抑制作用又明显高于游离阿霉素组（P<0.05）。结论：第一部分：本研究首次应用免疫组织化学方法检测PlGF在骨肉瘤组织和正常骨组织中的表达,同时应用Real-time PCR方法分别检测Livin和PlGF在三种不同骨肉瘤细胞株中的表达,分析Livin和PlGF的阳性表达与骨肉瘤患者的临床特征以及不同骨肉瘤细胞株的分化成熟程度之间的相关性,同时研究骨肉瘤组织中PlGF与Livin阳性表达之间的相关性。实验结果表明Livin和PlGF均在骨肉瘤组织以及三种骨肉瘤细胞株（MG-63、Saos-2以及U2-OS）中呈现高表达,Livin和PlGF在不同骨肉瘤细胞株中的表达差异可能与细胞的分化成熟程度相关。Livin和PlGF蛋白在骨肉瘤组织中的阳性表达之间不具有相关性。Livin及PlGF阳性表达与骨肉瘤患者年龄、性别、发病部位以及病理分型之间均不具有相关性,与骨肉瘤的肿瘤大小、肿瘤Enneking临床分期具有明显相关性,有可能与骨肉瘤的发生及发展相关。但两者是否可单独或同时作为骨肉瘤患者预后的判断指标需要进一步验证。随着研究的不断深入,Livin及PIGF可望成为骨肉瘤的基因治疗、免疫治疗的新靶点。第二部分：本研究中应用高碘酸钠引发的氧化反应,葡聚糖T40被氧化产生醛基,氧化葡聚糖可通过其分子中的醛基与阿霉素及聚乙烯亚胺分子中的游离氨基反应,以雪夫氏碱的形式将三者偶合成稳定的纳米基因载体。该偶合阿霉素的纳米载体能有效地缩合DNA从而以静电吸附的方式形成葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米基因复合物,该纳米基因复合物由于具有较小的粒径和阳性表面电荷,可通过其EPR效应选择性靶向肿瘤组织。通过其表面正电荷与肿瘤细胞结合而被细胞内吞,有效地将其携带的阿霉素以及目的基因材料同时转入骨肉瘤细胞中。第三部分：本研究构建了Livin shRNA真核表达载体并经基因测序验证了其准确性,该表达载体被转染入骨肉瘤MG-63细胞后可有效地下调细胞中Livin的mRNA和蛋白的表达。Livin shRNA质粒稳定转染的MG-63细胞的建立为今后进一步继续研究Livin在骨肉瘤细胞中的作用奠定了实验基础。葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米载体能将有效地阿霉素和Livin shRNA质粒同时转入骨肉瘤细胞（MG-63和Saos-2）中。由于葡聚糖酶对纳米载体中葡聚糖的降解作用,偶合在该纳米载体上的阿霉素被释放并发挥对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。与此同时,转染的Livin shRNA质粒通过RNA干扰的方式下调凋亡抑制蛋白Livin的表达,促使骨肉瘤细胞对阿霉素的敏感性增加,从而进一步诱导骨肉瘤细胞的凋亡。该纳米载体合成所用的葡聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性,氧化后依然保存着其良好的特性。随着纳米载体在体内的降解,低分子量PEI释放后可被排泄,其细胞毒性明显小于无排泄途径的高分子量PEI。低分子量PEI与氧化葡聚糖交联后其转染效率大大提高,与PEI 25K的转染效率相近。由于肿瘤血管通透性大于正常组织血管,纳米基因复合物可通过EPR效应而被动靶向富集于肿瘤组织,提高肿瘤局部的药物浓度并减少全身重要脏器的药物浓度,可在提高治疗效果同时减小全身副作用。MTT实验结果显示纳米载体介导的化疗联合基因表达的下调可在骨肉瘤细胞中产生协同抑制作用,并且该协同抑制作用明显高于阿霉素或葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亚胺纳米载体对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用。该研究可为应用纳米载体介导骨肉瘤的综合治疗提供必要的实验依据。
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