论文摘要
(S)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺是肾二肽脱氢酶抑制剂——西司他丁合成的关键中间体,市场需求广泛。目前,手性生物催化已成为制备光学纯化合物的经典方法,通过R-立体选择性酰胺酶动力学拆分,制备（S）-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺,反应条件温和、立体专一性好、环境友好,具有很好的工业化前景。本论文主要围绕R-酰胺酶产生菌的筛选、菌种的生理生化鉴定、培养条件与转化条件的优化等几方面展开研究。首先,本文通过一种基于酰基转移反应的光学选择性酰胺酶的筛选模型,从土壤中筛选到一株具有较严格的R-型选择性酰胺酶的产生菌株ZJB-07021,该菌株能够选择性转化外消旋体中的（R）-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺生成相应的酸。通过生理生化特征、Biolog的革兰氏阳性细菌检测试验卡（GP2）鉴定、16S rDNA序列分析,鉴定为表皮短杆菌（Brevibacterium epidermidis）。这也是Brevibacteriumepidermidis种内第一次报道的具有R-型酰胺酶产生菌,值得进一步研究。采用响应面（RSM）与单因素相结合的分析法,对R-酰胺酶产生菌B.epidermidis ZJB-07021的培养条件进行优化。首先运用了单因子试验筛选出了发酵培养的最佳pH、温度等条件,以及最适发酵培养基的组成成分。在此基础上采用Plackett-Burman（PB）设计法,对8种影响产酶的因素进行评价,实验结果表明,葡萄糖、酵母粉与乙酰胺含量对菌株产酰胺酶的活力具有显著的影响。通过旋转中心组合实验考察了葡萄糖、酵母粉和乙酰胺这三个主要因素对菌株所产酰胺酶活力的影响。发酵培养基优化结果为:葡萄糖17.00 gl-1酵母粉15.74 gl-1乙酰胺7.05 gl-1,采用优化后的发酵培养条件进行摇瓶发酵培养,酰胺酶的酶活达到72.14 Ul-1,比优化前的初始发酵培养条件下的酶活提高了73.3%。论文最后考察了酶催化反应的环境对B.epidermidis ZJB-07021酰胺酶催化的酶活与立体选择性的影响。确定pH 7.6的Tris-HCl缓冲溶液作为该酰胺酶最适的反应体系;通过温度影响实验我们发现,45℃时酶活最高,初速度达到28.2μmol min-1g-1,为14℃时的3.6倍,但其立体选择性随温度的升高而不断降低;根据Arrhenius方程拟合直线我们可以计算得到14～45℃范围内的表观活化能（Eα）为32.92 kJ mol-1;通过实验我们得到该酶催化反应过程的2个重要热力学参数:ΔΔH+=-37.3 kJ mol-1,ΔΔS+=-95.7 J mol-1;经计算该菌株胞内酰胺酶在35℃和40℃下的半衰期(t1/2)分别为36.23和23.73 h,说明该酰胺酶的热稳定性较好,这对进一步的工业化生产是十分有益的;通过共溶剂实验,我们发现向反应体系中添加10%（v/v）的甲醇后,酶活力提高了28.2%,立体选择性也有一定的提高。反应条件优化后,通过双倒数作图法,求得该反应条件下的反应动力学参数:Vmax=48.22μmol min-1g-1,Km=1.06 mM。
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标签：二甲基环丙甲酰胺论文; 酰胺酶论文; 动力学拆分论文; 高通量筛选论文; 生物转化论文;