油桐尺蠖核型多角体病毒p35基因的研究

论文摘要

本文研究了油桐尺蠖核型多角体病毒（Buzura suppressaria nuclear polyhedrosis virus,简称BsNPV）p35基因的抗凋亡功能。采用PCR的方法从BsNPV基因组中扩增出p35基因,并对它进行了序列测定,与其他病毒的p35基因相比,它的保守性非常强。把BsNPVp35基因克隆到原核表达载体pGEX-KG上,最终得到含有重组表达载体pGBp35的BL21重组菌。用IPTG对重组菌进行诱导,并对它进行时相分析。采用不连续系统垂直板SDS-PAGE对诱导后的蛋白进行分析。结果表明:表达蛋白的分子量约为62kD,大于35kD,这是由于pGEX-KG表达载体表达的是一融合蛋白,在P35蛋白之前还带有27kD的GST蛋白,两者融合而成。 我们还把BsNPVp35基因克隆到真核表达载体pIZ/V5-His上,并且突变了p35基因的终止密码子,在其后连接报道基因egfp,并使它们的读码框一致,重组载体命名为pIZ/V5-p35-egfp。用pIZ/V5-p35-egfp转染棉铃虫细胞,加入凋亡因子,观察BsNPV P35蛋白能否延缓棉铃虫细胞的凋亡。由于某些杆状病毒的p35基因不具有抗凋亡的能力,还由于杆状病毒的p35基因抗凋亡功能的发挥具有宿主特异性,所以这个结果有待分析。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1. 核型多角体病毒病毒概述
• 1.1 核型多角体病毒的发现、分类以及发展
• 1.2 核型多角体病毒的结构与功能
• 2. 细胞凋亡的研究进展
• 2.1 细胞凋亡的概念及生理意义
• 2.2 杆状病毒基因及性质
• 2.3 杆状病毒中与细胞凋亡相关的基因
• 3. 研究昆虫杆状病毒的意义
• 3.1 杆状病毒表达载体系统的开发应用
• 3.2 昆虫杆状病毒在生物防治中的作用
• 4. 实验设计
• 第一章 油桐尺蠖核型多角体病毒p35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
• 引言
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 BsNPV多角体的提纯
• 2.2 病毒基因组的提取
• 2.3 BsNPVp35基因的扩增、克隆与测序
• 2.4 感受态细胞的制备
• 2.5 酶切和连接
• 2.5.1 限制性酶消化反应
• 2.5.2 DNA连接反应
• 2.6 DNA对感受态细胞的转化、涂布及培养
• 2.7 质粒的提取
• 2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-APGE）
• 2.9 蛋白的表达及样品的处理
• 3. 结果
• 3.1 BsNPV基因组的提取及 PCR
• 3.2 TA克隆与测序
• 3.3 对 BsNPVp35基因序列的分析
• 3.4 对预测的 BsNPVP35蛋白的系统进化分析
• 3.5 原核表达质粒pGBp35的克隆与鉴定
• 3.6 BsNPVp35基因的表达与 SDS-PAGE电泳分析
• 4. 讨论
• 4.1 BsNPV基因组的提取
• 4.2 BsNPVP35基因结构及同源性分析
• 4.3 BsNPVP35蛋白的分子进化树分析
• 4.4 BsNPVP35蛋白的 SDS-PAGE电泳分析
• 第二章 BsNPV p35基因与棉铃虫细胞的互作
• 引言
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 目的基因的克隆及检测
• 2.2 pIZ/V5-p35-egft重组载体的构建
• 2.3 质粒的扩增
• 2.4 细胞培养及 DNA转染
• 2.4.1 昆虫细胞及其传代培养
• 2.4.2 Lipofectamin介导外源 DNA转染真核细胞
• 2.5 转染后对细胞表达情况的观察
• 2.5.1 苔盼蓝拒染实验
• 2.6 细胞凋亡的检测
• 2.6.1 光学显微镜观察
• 2.6.2 细胞 DNA的提取和电泳分析
• 2.6.3 彗星实验、电镜观察、流式细胞法
• 2.7 细胞表达外源蛋白的 SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳检测
• 3. 结果
• 3.1 BsNPVp35终止密码子的突变
• 3.2 BsNPVp35基因突变体的克隆和测序
• 3.3 pIZ/V5-p35重组载体的构建与鉴定
• 3.4 pIZ/V5-p35-egfp重组载体的构建与鉴定
• 3.5 细胞培养和 DNA转染
• 4. 讨论
• 第三章 运用 Bac-to-Bac表达系统研究 BsNPVp35基因与棉铃虫细胞在体内的互作
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 重组载体的构建
• 2.2 细胞培养及转染
• 2.3 细胞表达蛋白的 SDS-PAGE电泳分析
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢