甘蓝型油菜PEPC基因保守序列的克隆和种子特异性ihpRNA表达载体的构建

论文摘要

油菜是世界范围内广泛种植的油料作物,是世界食用植物油和植物蛋白的重要来源,在国际农产品贸易中占有重要的地位。它不仅是人和动物必须脂肪酸的主要来源,也是油漆、润滑剂、化妆品、尼龙等化工产品的重要原料。我国的油菜种植面积（主要在长江流域）超过1亿亩,占世界种植面积的1/3,为我国人民提供了50%左右的食用油。然而与加拿大等国家相比,我国多数油菜品种的含油量偏低:2005年前国际油菜籽的平均含油量大约42%,我国油菜籽的平均含油量仅为38%。目前我国油菜年产量在1300万吨左右,产油470万吨,占整个食用油的半壁江山（每年我国生产植物油850万吨左右）。而且我国食用油的生产和消费缺口很大（植物油消费总量在1200万吨左右）,2000年我国进口食用植物油179万吨,至2005年已增至621.1万吨,年均增长率达到28.2%,所以提高油菜产量,增加种植面积、提高油菜含油率（单位面积的产油率）就成为缓解食用油消费的当务之急。因此,高含油量油菜品质育种具有十分重要的现实意义。根据1999年陈锦清提出“底物竞争”假说,磷酸烯醇式丙酮酸梭化酶（PEPC）与油菜含油量有着密切的关系。其间接控制了油脂、蛋白质生物合成的共同底物磷酸烯醇式丙酮酸的流向,从而决定植物种子蛋白质/油脂含量比例。我们利用RNAi技术抑制PEPC,使可溶性糖更加充分地流入种子中的脂肪代谢途径,以望获得高含油量的转基因油菜。本研究作了以下工作并取得相关结果:1.寻找与油菜含油率积累呈负相关的基因（PEP）的保守序列利用PEPC（GenBank accession D13987）基因序列与GENBANK里已公布的植物基因做BLAST比对,发现PEPC基因上的一个外显子（位于2637-2859bp,命名为“S”）具有高度的保守性。2.克隆PEP基因的保守序列和napin启动子根据外显子S和napin（GenBank accession J02798）基因的序列,应用PrimerPremier5.0软件设计P1-P2,P3-P4两对特异性引物。在以甘蓝型油菜（Brassicanapus L.）基因组DNA为模板分别扩增出PEPC和napin基因片段。再把PEPC和napin基因片段分别克隆到载体pMD18-T上,送公司测序鉴定,确认所克隆的序列为PEPC基因片段和Napin启动子序列。3.构建反向重复框利用质粒载体pBS-NEI（此载体有两个特点:1、内含子片段NEI（130bp）来自甘蓝型油菜PEPC基因,由上海鼎安科技有限公司人工合成,2、内含子5’端反向插入载体pBS-NEI中）,在内含子片段NEI两端选择合适的酶位点,把PEPC基因片段一个正向插入,一个反向插入,建成具有反向重复框的载体pBS-B2-NEI-B1。4.种子特异表达载体pCAMNapin的构建从pMDNapin载体上,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切切下来的Napin基因片段与经同样双酶切的植物表达载体pCAMBIA1391连接,得到载体pCAMNapin5.PEPC基因ihpNRA植物表达载体的构建把从pBS-B2-NEI-B1载体上,用酶切下的反向重复框连接到经同种酶切且去磷酸化的表达载体pCAMNapin上,再克隆到感受态细胞中,然后用酶切鉴定和测序鉴定两种手段,最终选取内含子5’端与载体pCAMNapin同方向的重组质粒,得到PEPC基因ihpRNA植物表达载体pCAMNapin-B2-NEI-B1。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 1.1 油菜含油量的研究进展
• 1.1.1 我国油菜的分布、产量状况和目前的含油率水平
• 1.1.2 我国食用油消费现状
• 1.1.3 油菜籽油的形成过程
• 1.1.3.1 植物中糖类物质的生成
• 1.1.3.2 在种子形成过程中蔗糖转化为脂肪酸
• 1.1.3.3 脂肪酸在种子中的储存
• 1.1.4 控制菜籽含油量的关键酶
• 1.1.4.1 6-磷酸葡萄糖脱氢酶
• 1.1.4.2 乙酰CoA羧化酶
• 1.1.4.3 磷脂酸磷酸脂酶
• 1.1.4.4 二脂酰甘油酰基转移酶
• 1.1.4.5 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
• 1.1.5 油菜含油率改良的主要手段
• 1.1.5.1 常规育种
• 1.1.5.2 诱变育种
• 1.1.5.3 基因工程技术
• 1.2 RNAi技术
• 1.2.1 RNAi的内含
• 1.2.2 RNAi的历史背景
• 1.2.3 RNAi的作用机理
• 1.2.4 RNAi的特点
• 1.2.5 RNAi在植物中的应用
• 1.2.5.1 RNAi可作为农作物基因改良的有效工具
• 1.2.5.2 RNAi可用于植物抗病研究
• 1.2.5.3 RNAi在作物品质中的改良应用
• 1.3.本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 载体
• 2.1.4 试剂与酶
• 2.1.5 试剂盒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PEPC基因保守序列的选择与确定
• 2.2.2 PCR引物的设计
• 2.2.3 油菜DNA的提取
• 2.2.4 E.coli DH5a感受态细胞的制备
• 2.2.5 napin启动子的克隆
• 2.2.5.1 PCR扩增
• 2.2.5.2 PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化
• 2.2.5.3 连接克隆载体pMD18-T
• 2.2.5.4 重组子鉴定
• 2.2.5.4.1 重组质粒提取
• 2.2.5.4.2 BamHI和HindⅢ双酶切鉴定
• 2.2.5.4.3 测序和BLAST比对鉴定
• 2.2.6 甘蓝型油菜PEPC基因片段的克隆
• 2.2.7 种子特异表达载体pCAMNapin的构建
• 2.2.7.1 植物表达载体pCAMBIA1391的克隆
• 2.2.7.2 大量提取质粒
• 2.2.7.3 BamHI和HindⅢ双酶切
• 2.2.7.4 片段连接与转化
• 2.2.8 反向重复框的构建
• 2.2.8.1 酶切载体pMDPEPC
• 2.2.8.2 中间载体pBS-NEI-B1的构建
• 2.2.8.3 反向重复框载体pBS-B2-NEI-B1的构建
• 2.2.9 PEPC基因ihpRNA植物表达载体的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 保守序列寻找与确定
• 3.2 PEPC基因片段的克隆及分析
• 3.3 Napin启动子的克隆及分析
• 3.4 种子特异表达载体pCAMNapin的构建
• 3.5 反向重复框的构建
• 3.6 种子特异性表达的ihpRNA植物载体构建
• 4 讨论
• 4.1 甘蓝型油菜中PEPC基因的特性
• 4.2 基因片段的克隆
• 4.3 启动子的选择
• 4.4 ihpRNA载体的沉默效率
• 参考文献
• 致谢