蔬菜土壤生态系统微生物分子生态学研究

论文摘要

微生物在农业生态系统中营养元素循环、有机物质的形成和分解、土壤肥力的保持和提高、生态环境改善、植物生长发育的调节、作物病虫害防治等方面起着极其重要的作用。由于传统培养方法的局限性（仅有约1%的土壤微生物可人工培养）,使人们不能全面客观的认识微生物的多样性。本研究采用分子生物学技术,对蔬菜生态系统中有关的微生物多样性进行了研究,结果如下: 1.为探讨同一区域不同栽培制度对土壤细菌多样性的影响,应用16S rDNA PCR-RFLP方法,对菜田和水稻田土壤细菌群落结构进行了比较研究,建立了两种类型土壤细菌的16S rDNA克隆库,对阳性克隆进行PCR扩增,并对扩增产物进行了限制性内切酶Hinf 1酶切片段多态性分析（RFLP）分析。在菜田土壤中共得到了75个阳性克隆和33种16S rDNA基因型,在水稻田土壤中共得到了55个阳性克隆和17种16S rDNA基因型。与水稻田土壤相比,菜田土壤具有较高的多样性,且大多数克隆属于Proteobacteria gamma, alpha和beta类细菌,有少部分属于high G+C bacteria, Chloroflexus和Nitrospina类细菌。相反在水稻田土壤中大约一半的克隆属于Proteobacteria gamma和beta类细菌,其余的属于high G+C bacteria, Prosthecobacter和Sphingobacterium类细菌。 2.应用18S rDNA PCR-RFLP方法,对菜田和水稻田土壤真菌群落结构进行了比较研究,建立了两种类型土壤的18S rDNA克隆库,对阳性克隆进行PCR扩增,并对扩增产物进行了限制性内切酶Hinf 1酶切片段多态性分析（RFLP）分析。在菜田土壤中共得到了82个阳性克隆和26种18S rDNA基因型,大多数克隆属于Ascomyta类真菌,其余属于Basidimycota, Chytridiomycota和Zygomycota类真菌;在水稻田土壤中共得到了84个阳性克隆和23种18S rDNA基因型,大部分克隆属于未分类真菌（unclassified fungi）,其余属于Chytridimycota, Ascomycota和Zygomycota类真菌。研究发现,菜田土壤真菌的辛普森多样性指数要略高于水稻田土壤;在菜田土壤中存在水稻田土壤中未发现的Basidimycota类真菌;而在水稻田土壤中存在菜田土壤中未发现的未分类真菌。菜田土壤真菌群落多样性要稍高于水稻田土壤。 3.采用从土壤中直接提取微生物总DNA,并用细菌16S rDNA特异性引物进

论文目录

• 摘要
• 第一章 前言
• 1.微生物的多样性
• 1.1.微生物物种的多样性
• 1.2.微生物适应多样性
• 1.3.微生物代谢多样性
• 1.4.微生物遗传多样性
• 2.微生物多样性在农业生态系统中的作用
• 2.1.对矿质元素的代谢
• 2.2.对作物生长的作用
• 2.3.对农业生态系统的不利影响
• 2.4.对土壤结构形成的作用
• 3.影响土壤微生物多样性的因素
• 3.1.土壤条件
• 3.2.农业耕作方式
• 3.3.种植制度
• 3.4.农田植被类型
• 4.微生物多样性研究方法进展
• 4.1.传统的微生物培养方法
• 4.2.BIOLOG微平板方法
• 4.3.磷脂脂肪酸方法
• 4.4.分子生物学方法
• 5.本项研究工作的目的与意义
• 第二章 菜田与水稻田土壤细菌多样性比较
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 2.1.材料
• 2.2.土壤样品采集
• 2.3.土壤总DNA的提取
• 2.4.16SrDNA PCR扩增
• 2.5.PCR产物的纯化、转化及克隆
• 2.6.限制性内切酶酶切
• 2.7.PCR-RFLP图谱分析
• 2.8.测序与序列分析
• 2.9.多样性指数计算
• 3.结果
• 3.1.总DNA提取和PCR扩增的结果
• 3.2.菜田和水稻田土壤细菌群落比较
• 3.4.序列分析的结果
• 4.讨论
• 第三章 菜田与水稻田土壤真菌多样性比较
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 2.1.材料
• 2.2.土壤样品采集与总DNA的提取
• 2.3.18S rDNA PCR扩增
• 2.4.PCR产物的纯化、转化及克隆的鉴定
• 2.5.限制性内切酶酶切及分析
• 2.6.测序与序列分析
• 2.7.多样性指数计算
• 3.结果与分析
• 3.1.DNA提取和PCR扩增产物的结果
• 3.2.菜田与水稻田真菌群落比较
• 3.3.序列分析结果
• 4.讨论
• 第四章 蔬菜作物连作对土壤中细菌多态性影响的分子生态学研究
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 2.1.变性梯度凝胶电泳（DGGE）所需溶液的配制
• 2.2.材料
• 2.3.土壤样品
• 2.4.土壤中微生物总DNA的直接提取
• 2.5.直接PCR扩增
• 2.4.巢式PCR扩增
• 2.5.变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
• 2.6.细菌16S rDNA片段的克隆和测序
• 2.7.序列分析
• 3.结果分析
• 3.1.从土壤中直接提取微生物总DNA
• 3.2.直接PCR与巢式PCR扩增产物，经DGGE分析的结果比较
• 3.3.不同蔬菜作物连作对土壤中细菌16S rDNA多态性分析
• 3.4.细菌16S rDNA片段的序列分析
• 3.5.测序结果的生物信息学分析
• 4.讨论
• 4.1.直接与巢式PCR-DGGE结果比较
• 4.2.不同蔬菜连作及连作时间对土壤细菌群落的影响及原因探讨
• 4.3.蔬菜连作土细菌类群分析
• 第五章 不同施肥条件对菜田土壤细菌群落的影响
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 2.1.材料
• 2.2.土壤材料
• 2.3.土壤总DNA的提取
• 2.4.细菌16S rDNA PCR-DGGE分析
• 2.5.细菌16S rDNA克隆库的构建
• 2.6.PCR-RFLP分析
• 2.7.测序与序列分析
• 3.结果与分析
• 3.1.DGGE的分析结果
• 3.2.长期不同施肥条件下土壤细菌16S rDNA PCR-RFLP分析结果
• 3.3.测序结果分析
• 4.讨论
• 第六章 抗感青枯病番茄品种根表细菌群落多样性研究
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 2.1.材料
• 2.2.抗感青枯病番茄材料
• 2.3.抗性检测试验
• 2.4.根表微生物总DNA的提取
• 2.5.根际微生物总DNA的提取
• 2.6.番茄青枯病的病情调查分级标准
• 2.7.PCR-DGGE分析
• 2.8.PCR-RFLP分析
• 2.9.多样性指数计算
• 2.9.测序与序列分析
• 3.结果分析
• 3.1.抗感青枯病番茄的抗性检测结果
• 3.2.抗感品种接种与未接种根表细菌的DGGE图谱分析
• 3.3.番茄青枯病不同发病程度根际细菌DGGE分析
• 3.4.抗感青枯病番茄根表细菌群落比较
• 3.5.抗感青枯病番茄根表细菌类群分析
• 4.讨论
• 第七章 不同磷钙元素水平番茄营养液中细菌多样性研究
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 2.1.材料
• 2.2.试验设计
• 2.3.营养液总DNA的提取
• 2.4.16S rDNA PCR扩增
• 2.5.变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析
• 2.6.测序及序列分析
• 3.结果与分析
• 3.1.从营养液中提取的总DNA
• 3.2.PCR扩增产物
• 3.3.DGGE分析结果
• 3.4.序列分析结果
• 4.讨论
• 第八章 主要结论及问题与展望
• 1.主要结论
• 2.问题与展望
• 参考文献
• Abstract
• 致谢