论文摘要
原发性肝癌是中国常见的恶性肿瘤之一,早期诊断率不高,预后差,5年生存率低。AFP是目前广泛应用于诊断肝癌的血清学标志物,但是有1/3的肝癌患者AFP表达为阴性；其他血清学标志物,如碱性磷酸酶、γ羧基凝血酶原和一些组织特异的抗原等,临床诊断价值都不理想。在小肝癌（<3 cm）中AFP阳性率更低,仅为25%,临床表现较轻且缺乏特异性,诊断依赖于多种影像学检查和病理学检查,在临床上应予以高度重视。因此,迫切需要发现AFP阴性肝癌新的早期生物标志物。近年来,稳定同位素标记结合质谱的定量蛋白质组（iTRAQ）技术方法的建立,使肝癌新标志物的发现提升到一个更高的水平。本研究通过去除血清中的高丰度蛋白,联合定量蛋白质组技术,筛选出一组与AFP阴性肝癌患者相关的有潜在应用价值的差异蛋白质,并利用生物信息学分析挑选的关键分子,通过免疫印迹和组织芯片进行表达验证,建立ROC诊断模型；并对血清结合珠蛋白β亚基的表达和其N-聚糖在乙肝病毒相关肝病的诊断价值进行了系统分析。第一部分AFP阴性肝癌患者血清学标志物筛选、验证和诊断价值（iTRAQ 2D-LC ESI-MS/MS）本部分的目的在于筛查AFP阴性肝癌患者表达相关的差异分子。所有血清均取自我院和广西医科大学标本库,均有完整的生化资料和临床病理资料,根据AFP阴性和阳性,分为AFP阴性肝硬化组,AFP阴性肝癌组和AFP阳性肝癌组。通过MARS柱去除血清中的14种高丰度蛋白进一步浓缩后,分别进行稳定同位素114,115和117iTRAQ标记,经过强阳离子柱分离和反相色谱柱分离,质谱鉴定分析差异蛋白,应用生物信息学工具进行统计分析和解读,同时利用免疫印迹方法对AFP阴性和阳性的肝硬化和肝癌样本中对部分差异蛋白进行小样本验证；并采用免疫组化的方法检测肝癌相关肝病组织切片（AFP阴性肝硬化和早期肝癌）中PON1的表达。最后,利用免疫印迹方法对46例肝硬化和28例AFP阴性的肝癌病人血清样本的PON1和ATⅢ的表达进行了验证结果发现,经iTRAQ肽段实验标记,Q-star质谱最多得到17034个有差别的肽段,MASCOT搜库（去冗余后）鉴定到494个蛋白（95%可信度）。在三次实验中,分别鉴定到的蛋白数量分别为224、350和276个。按照Ratio>1.2（上调）或Ratio<0.8（下调）,且P<0.05为标准筛选,共有81个含定量信息的差异表达蛋白。其中表达上调1.2倍以上蛋白45个,表达下调1.2倍以上蛋白共36个。利用生物信息学技术在GO分类、生物通路和蛋白质相互作用STRING网络水平上进行研究,发现与炎症与凋亡相关的通路被激活；免疫印迹验证显示,PON1在血清AFP阴性的肝硬化中表达高于AFP阴性肝癌组,ATⅢ在血清AFP阴性的肝硬化中表达低于AFP阴性肝癌组。经Logist回归分析,两种蛋白的AUC（ROC曲线下面积）分别为0.676和0.793,两者联合诊断面积为0.834。结果表明,低丰度蛋白的富集结合定量蛋白质组学,是较新的、可行的蛋白质组学研究策略之一。本研究筛查出与AFP阴性肝硬化和肝癌患者相关的差异蛋白PON1和ATⅢ,可能作为AFP阴性肝癌患者早期诊断或辅助诊断的分子标志。第二部分血清结合珠蛋白β亚基的表达和糖基化在乙肝病毒相关肝病的诊断价值本部分的目的是研究血清结合珠蛋白p亚基（Hp-β）的蛋白和其岩藻糖基化在乙肝病毒相关肝病过程中的诊断价值。利用免疫比浊法检测乙肝病毒相关的肝病过程（慢性迁延性肝炎（HBV组）、肝硬化（LC组）和肝癌（HCC组））中Hp含量的变化,特别是分析血清AFP阴性的肝硬化和肝癌患者血清中Hp含量变化及其诊断价值。此外,以正常血清样本（N组）为对照,利用凝集素印迹分析乙肝病毒相关的肝病过程中Hp-β糖链的变化,HPLC分析Hp-β糖链结构,并进一步用免疫印迹验证。结果表明,Hp蛋白含量在肝病的进程中,呈先降低、再升高的趋势。Hp在区别AFP阴性肝硬化和和肝癌的AUC为0.763,敏感性和特异性分别为63.3%和80.2%。在Hp-β的糖链变化上,肝硬化组和肝癌组的AAL凝集素特异性结合能力比正常组和肝炎组高,有统计学差异。说明在肝硬化组和肝癌组中Hp-β所含末端岩藻糖增多。此外,SNA凝集素结合实验表明,正常对照组、肝炎组和肝癌组中结合的唾液酸比肝硬化组多。经HPLC分析,Hp-β亚基中增高的岩藻糖结构为Lewis x,这一结果经过了抗Lewis x的抗体免疫印迹验证。本研究发现,Hp-β蛋白水平可以区分AFP阴性肝硬化和肝癌患者,而Hp-β的Lewis x水平可作为区分肝炎和肝硬化的标准物,进一步说明它在乙肝病毒相关肝病过程中有着重要的诊断价值。结论1.应用iTRAQ联合LC-MS/MS技术,对AFP阴性肝硬化、AFP阴性肝癌和AFP阳性肝癌患者的血清样本比较,鉴定出494个蛋白,三次生物学重复去冗余后,P<0.05的差异表达的蛋白有81个,在AFP阴性肝癌中表达上调蛋白45个,表达下调蛋白36个；2.PON1和ATⅢ联合的AUC （ROC曲线下面积）为0.834,敏感度为46.43%,特异度为95.65%,可能作为AFP阴性肝癌患者早期诊断和辅助诊断的分子标志。3.Hp蛋白含量在肝病的进程中呈现先降低再升高的趋势,区分AFP阴性肝硬化和肝癌患者AUC为0.763,敏感性和特异性分别为63.3%和80.2%,存在一定的诊断价值；4.Hp-β糖链中含有Lewis x结构,在肝硬化和肝癌中的含量比正常组都高,可以作为区分肝炎和肝硬化的潜在标志物。潜在应用价值1.PON1和ATⅢ可作为AFP阴性肝癌的预测指标。2.血清结合珠蛋白β链在在蛋白水平和糖基化水平变化的不一致,有助于对肝病患者的早期诊断。创新点1.低丰度蛋白的富集结合定量蛋白质组学技术,克服了以往传统技术上的一些弱点,并且采用AFP阴性的患者直接进行血清定量蛋白组学的分析,区别于以往的AFP阴性患者和其它肝癌患者混在一起研究,筛查出一组关键差异蛋白分子,对AFP阴性肝癌诊断和治疗有所帮助。2.证实血清差异蛋白PON1和ATⅢ联合诊断AFP阴性肝癌中的诊断价值,为其进一步进入临床诊断应用提供可能。3.血清结合珠蛋白β链在蛋白水平和糖基化水平的不一致变化,对肝病患者的诊断有价值。