丹参叶遗传转化体系的建立及HMGR基因3’片段的克隆

论文摘要

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我国的一种传统中药材。现代药理研究表明,丹参对心血管系统和血液系统的作用十分显著。以丹参为主的多种复方制剂如复方丹参注射液、复方丹参片、复方丹参胶囊和复方丹参滴丸（1997年向美国FDA以治疗药身份申报的品种）等已被广泛用于临床治疗心血管疾病、肾病、肝病及抗感染等。但是,由于丹参生长周期长（2年以上）,在传统的栽培模式下,面临着品质严重退化、生产成本相对过高等诸多弊端;离体条件下产生的丹参组培苗,其药用活性成分的积累量还远达不到商业化开发利用的要求。因此,利用现代基因工程技术将丹参药用活性成分生物合成途径中的关键酶基因导入到丹参中,获得转基因的发根、细胞系或再生植株,并进行大规模的培养,是提高丹参药用活性成分的含量和解决丹参药源问题的最佳途径之一。而深入地研究丹参的遗传转化体系,分离克隆其药用活性成分生物合成途径中的关键酶基因,是解决这一问题的前提和关键。本文以丹参为实验材料,从丹参叶的不同部位对愈伤诱导及分化的影响、不同激素及培养基等对植株生根的影响、丹参毛状根的转化频率的影响因素、毛状根的离体培养条件和植株再生条件、毛状根药用活性成分的积累规律的初探和药用活性成分生物合成途径中的关键酶基因的分离克隆等角度开展了一系列的工作,取得了以下结果:一、丹参叶再生体系的建立。试验结果表明叶的不同部位对愈伤诱导分化具有差异,其中以叶的形态学下端愈伤诱导率最高,达到了88.9%;其次是叶柄,为80%;而叶的形态学上端最差,仅为61.10%。不同来源的愈伤对丹参的出芽率和平均出芽数都存在极显著的影响,其中叶柄愈伤的出芽率最高,达到了92.6%;平均出芽个数最多,为6.3个;与另外三种培养基（White、1/2MS和MS）相比,B5培养基为促进生根的最适基本培养基;在生根阶段加入一定量的生长激素能有效地提高芽的生根率、平均根数和平均根长,以1mg/L的IBA为最佳。二、优化了丹参毛状根的诱导条件。实验表明:菌株和外植体类型对丹参毛状根诱导率存在着显著的差异。与A4和R1601相比,C58C1（改造过）为最适菌株;三种外植体（叶片、叶柄和茎段）中,以叶片为外植体更有利于丹参毛状根的产生;最佳共培养时间为3-4天;乙酰丁香酮（AS）浓度为400 uM/L最有利于促进毛状根的产生。三、研究了丹参毛状根的离体培养条件。实验表明,1/2MS液体培养基最适合丹参毛状根的生长;蔗糖为最适合丹参毛状根生长的碳源,无机铵盐与有机氨（如水解乳蛋白、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏）相比更适合丹参毛状根的生长; 0.5 mg/L的6-BA有利于促进离体丹参毛状根的生长。四、进行了稀土元素对丹参毛状根中药用活性成分的诱导合成的初步研究。实验表明,稀土元素处理样中的三种丹参酮的含量皆远大于丹参植株的根和未处理的普通毛状根,其总丹参酮的含量达到了1.800mg/g,分别是植株的根和普通毛状根的1.49倍和4.85倍。五、研究了丹参毛状根再生条件。实验表明,不同的培养基对丹参毛状根分化出芽存在着显著的影响,MS液体基本培养基与其它三种液体基本培养基相比,更适合丹参毛状根芽的分化。丹参毛状根离体培养在MS液体培养基中15天后,其芽的分化率可以达到37.5%。六、成功地从丹参中克隆得到了HMGR基因的3’片段,该片段长622bp,通过生物信息学分析,结果表明所得到的序列即为丹参HMGR基因的3’片段。本项研究成功地建立了丹参叶的离体再生系统,为利用根癌农杆菌介导的遗传转化技术进行丹参的品质改良继而获得丹参优良品系提供了转化技术的保障;本文成功地建立了丹参的发根诱导体系,这为丹参的遗传改良提供了另一条候选途径,通过对丹参发根的离体培养条件的优化研究,为今后利用发酵培养技术商业化生产丹参活性成分提供了参考依据;此外,本文还从丹参中克隆了其药用活性成分生物合成途径中的关键酶基因HMGR的3’片段（全长基因正在克隆当中）,为利用基因工程手段进行丹参代谢活性成分的分子调控奠定了基础,开展上述研究具有重要的理论和实际意义。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写词表
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1.1 发根农杆菌在药用植物中的研究方向和应用
• 1.1.1 发根农杆菌中的Ri T-DNA基因
• 1.1.2 发根的离体培养和次生代谢物的产生
• 1.1.3 发根农杆菌介导的植株再生
• 1.2 丹参的研究现状
• 1.2.1 丹参的主要药用成分和应用价值
• 1.2.2 丹参的离体培养
• 1.2.2.1 丹参的植株再生
• 1.2.2.2 人工诱导多倍体
• 1.2.2.3 丹参的细胞培养
• 1.2.3 丹参毛状根的离体培养
• 1.2.4 丹参的基因工程
• 1.2.4.1 丹参二萜类成分的生物合成
• 1.2.4.2 农杆菌介导的丹参遗传转化
• 1.3 展望
• 1.4 本项研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 购买的试剂、酶及药品
• 2.1.5 常用试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 无菌苗的获得
• 2.2.2 丹参叶再生体系的建立
• 2.2.2.1 培养基和培养条件
• 2.2.2.2 方法
• 2.2.3 丹参毛状根的诱导与鉴定
• 2.2.3.1 培养基和培养条件
• 2.2.3.2 方法
• 2.2.4 丹参毛状根离体培养条件的优化及其药用活性成分的测定
• 2.2.4.1 培养基和培养条件
• 2.2.4.2 方法
• 2.2.5 发根农杆菌介导的丹参植株再生
• 2.2.5.1 培养基和培养条件
• 2.2.5.2 方法
• 2.2.6 丹参RNA的提取及检测
• 2.2.6.1 准备工作
• 2.2.6.2 RNA的提取
• 2.2.6.3 RNA质量检测分析
• 2.2.7 HMGR 3’端基因的克隆及序列的生物信息学分析
• 2.2.7.1 丹参3’cDNA的合成
• 2.2.7.2 HMGR 3’端基因的克隆
• 2.2.7.3 凝胶电泳条带的柱层析纯化回收
• 2.2.7.4 DNA回收片段与pMD18-T vector 载体的连接
• 2.2.7.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备（CaC12法）
• 2.2.7.6 DNA与pMD18-Tvector的连接产物转化DH5α感受态细胞.
• 2.2.7.7 阳性克隆的筛选及测序鉴定
• 2.2.7.8 HMGR 3’端序列的生物信息学分析
• 第三章 实验结果与分析
• 3.1 无菌苗的获得
• 3.2 丹参叶再生体系的建立
• 3.2.1 叶的不同部位对丹参愈伤诱导率的影响
• 3.2.2 不同类型的愈伤对丹参愈伤分化的影响
• 3.2.3 丹参芽的生根
• 3.2.3.1 植物生长调节物质对丹参芽生根的影响
• 3.2.3.2 不同的培养基对丹参芽生根的影响
• 3.2.4 小结与讨论
• 3.3 丹参毛状根的诱导与鉴定
• 3.3.1 不同的发根农杆菌菌株对丹参毛状根诱导率的影响
• 3.3.2 不同的外植体对丹参毛状根诱导率的影响
• 3.3.3 菌液浓度对丹参毛状根诱导率的影响
• 3.3.4 共培养时间对丹参毛状根诱导率的影响
• 3.3.5 乙酰丁香酮（As） 对丹参毛状根诱导率的影响
• 3.3.6 毛状根的PCR鉴定
• 3.3.7 小结与讨论
• 3.4 丹参毛状根离体培养条件的优化及其药用活性成分的测定
• 3.4.1 不同的培养基对毛状根生长的影响
• 3.4.2 不同的碳源和氮源对毛状根生长的影响
• 3.4.3 植物生长调节物质对丹参毛状根生长的影响
• 3.4.4 稀土元素对丹参毛状根药用活性成分含量的影响
• 3.4.5 研究小结与讨论
• 3.5 发根农杆菌介导丹参的植株再生
• 3.5.1 不同的培养基对丹参毛状根芽分化的影响
• 3.5.2 丹参毛状根再生植株的分子鉴定
• 3.5.3 小结与讨论
• 3.6 丹参RNA的提取及检测
• 3.7 丹参HMGR 3’端基因的克隆及序列的生物信息学分析
• 3.7.1 基因克隆及序列分析
• 3.7.2 小结与讨论
• 第四章 总结与展望
• 4.1 研究结论
• 4.2 本研究的主要创新点
• 4.3 后续的研究工作
• 附录图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果