中药地骨皮的化学成分与质量控制方法研究

论文摘要

地骨皮（Cortex Lycii）为茄科（Solanaceae）植物枸杞（Lycium chinense Mill.）或宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的干燥根皮,收载于2010版《中国药典》一部,其性寒,味甘,归肺、肝、肾经。具有凉血除蒸、清肺降火之功效,主要用于阴虚潮热,骨蒸盗汗,肺热咳嗽,咯血,衄血及内热消渴等症。现代药理学研究发现地骨皮还具有降低血糖,血压和抗菌的作用。本文以地骨皮为研究对象,对其化学成分进行系统的分离和分析研究,在此基础上建立科学合理的质量控制方法。采用溶剂法和各种色谱分离技术,从地骨皮（the root bark of Lycium chinense Mill.）中共分离得到了52个化合物,鉴定了其中48个化合物的结构,包括简单酚酸类8个,苯丙素类9个,酚酰胺类16个,黄酮类3个,环肽类4个,其它类型化合物8个。这些化合物中有8个新化合物,分别是（E）-3-{（2,3-trans）-2-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-3-hydroxymethyl-2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6-yl}-N-（4-hydro-xyphenethyl）acrylamide （1）, （Z）-3-{（2,3-trans）-2-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-3-hydroxymethyl-2,3-dihydrobenzo[b] [1,4]dioxin-6-yl}-N-（4-hydroxyphenethyl）acryla-mide （2）, （2,3-trans）-3-（3-hydroxy-5-methoxyphenyl）-N-（4-hydroxyphenethyl）-7-{（E）-3-[（4-hydroxyphenethyl）amino]-3-oxoprop-1-en-1-yl}-2,3-dihydrobenzo[b][1,4]-dioxine-2-carboxamide （3）, （2,3-trans）-3-（3-hydroxy-5-methoxyphenyl）-N-（4-hydro-xyphenethyl）-7-{（Z）-3-[（4-hydroxyphenethyl）amino]-3-oxoprop-1-en-1-yl}-2,3-dihyd robenzo[b][1,4]dioxine-2-carboxamide （4）, （E）-2-（4,5-dihydroxy-2-{3-[（4-hydroxyp-henethyl）amino]-3-oxopropyl}phenyl）-3-（4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl）-N-（4-hydroxyphenethyl）acrylamide （5）, （E）-2-（4,5-dihydroxy-2-{3-[（4-hydroxyphenethyl）-amino]-3-oxopropyl}phenyl）-3-（4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl）-N-（4-acetamidobu-tyl）acrylamide （6）, （E）-2-（4,5-dihydroxy-2-{3-[（4-hydroxyphenethyl）amino]-3-oxopropyl}phenyl）-3-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-N-（4-acetamidobutyl）acrylamide（7）,（1,2-trans）-N3-（4-acetamidobutyl）-1-（3,4-dihydroxyphenyl）-7-hydroxy-N2-（4-hydroxyphenethyl）-6,8-dimethoxy-1,2-dihydro-naphthalene-2,3-dicarboxamide（8）。有12个化合物为首次从该属中分离得到。对分离得到的酚酰胺类化合物的自由基清除活性进行了测定：采用两个体外模型腺苷单核苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）和蛋白酪氨酸磷酸酶1 B（protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1 B）,对环肽类化合物的降血糖活性进行了筛选。采用LTQ-orbitrap高分辨质谱对分离得到的酚酰胺类和环肽类化合物的质谱裂解行为进行了系统分析。在正离子模式下,酚酰胺类成分的酰胺键容易断裂,在二级质谱图中可以明显看到丢失酪胺分子（137Da）或者N-（4-aminobutyl）-acetamide分子（130 Da）的碎片离子；顺反异构体具有相同的质谱裂解行为,但是其色谱保留时间和紫外光谱图存在差异。这些结论为鉴定地骨皮中酚酰胺类结构提供了重要依据。采用液质联用技术,对酚酰胺类化合物的富集部位进行了分析,指认了39个色谱峰,其中16个是通过与对照品对照,23个是利用裂解规律并结合紫外光谱信息和色谱保留行为推测的,其中12个化合物的结构为首次报道。另外,对4个环肽类化合物lyciumins A-D的多级质谱裂解行为进行了分析,利用特征性的碎片离子和中性丢失,推测了4个相同类型的未知化合物的结构。由于地骨皮化学组成非常复杂,主要成分的定量分析采用了快速液相色谱串联三重四极杆质谱的方法,使用多重反应监测模式（multiple reaction monitor, MRM）对24个化合物进行了定量分析,包括11个酚类化合物,9个酚酰胺类和4个环肽类化合物,该方法具有高灵敏度和高选择性的显著优势。对该方法进行了方法学验证,测定分析了28批不同产地的药材,包括4批伪品白地骨皮。结果显示,酚酰胺和环肽类成分为地骨皮中的特征性成分,可用于鉴别分析。对每类成分的总含量进行统计,发现环肽类化合物的含量是测定成分中最大的,其次为酚酰胺类。采用主成分分析法（Principle Component Analysis,PCA）对不同药材中化合物的含量进行了比较研究,结果表明环肽类的成分含量与地骨皮产地相关性最大。此部分研究工作为建立地骨皮合理的质量控制标准提供了科学依据。中国药典（2010版）收载地骨皮质量标准包括薄层鉴别和检查项,尚无含量测定方法。本文按照“深入研究,浅出标准”的指导思想,在对地骨皮化学成分系统分离分析的基础上,建立了质量控制方法,包括薄层鉴别,特征图谱定性分析和HPLC含量测定等质量控制方法。选择环肽类化合物lyciumins A-D为指标成分建立了薄层色谱鉴别方法,可以成功的把伪品白地骨皮鉴别出来。以含量较大的lyciumins A和B为指标建立了液相定量方法,并对不同产地药材中含量的差异性进行了分析,建议将二者含量之和来制定质量标准的限度要求。由于地骨皮化学成分种类和数量繁多,难以建立满意的总提物色谱指纹图谱,故实验采用萃取和大孔吸附树脂分离技术得到酚酰胺类成分的富集部位,建立了其特征图谱,并采用相似度分析对不同产地药材进行了一致性评价。该部分将为地骨皮质量标准的提升提供重要依据。环肽类化合物,作为地骨皮的专属性成分,在质量标控制方法建立时,被选为指标成分,因此如何快速的分离得到大量的单体化合物,对于方法的实施将起到重要的作用。本文尝试采用逆流色谱技术对地骨皮中的四个环肽lyciumins A-D进行分离。通过一次逆流色谱分离,从环肽富集部位中分离得到四个成分,经液相色谱检测,其纯度在90%以上。与传统的柱色谱分离方法相比,该方法具有简单、快速、样品回收率高等优点。综上所述,本文对地骨皮的化学成分进行了系统的分离和分析研究,充分阐明了该药材的化学物质基础,并且建立了简单可靠的质量控制方法,为地骨皮质量标准的提升提供了科学依据,也为该药材的合理规范使用和进一步药理学研究打下了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 枸杞属植物的化学成分研究进展
• 1.2 地骨皮的药理活性研究进展
• 1.3 枸杞子与地骨皮的质量控制方法研究现状
• 1.4 本研究立题依据和目的
• 参考文献
• 第二章 地骨皮化学成分的分离、结构鉴定与活性研究
• 2.1 仪器和试剂
• 2.2 植物材料
• 2.3 提取和分离
• 2.4 新化合物的解析
• 2.5 知化合物的鉴定
• 2.6 酚酰胺类化合物的抗氧化活性研究
• 2.7 Lyciumins A-D的降血糖活性筛选
• 2.8 小结
• 参考文献
• 第三章 地骨皮中酚酰胺类和环肽类成分的质谱裂解行为研究
• 3.1 药品与试剂
• 3.2 仪器
• 3.3 色谱与质谱条件
• 3.4 对照品溶液与供试品溶液的制备
• n裂解行为研究'>3.5 酚酰胺类和环肽类化合物的ESI-MSⁿ裂解行为研究
• 3.6 地骨皮中酚酰胺类成分的指认及相似未知结构的推测
• 3.7 四个未知肽类化合物的结构推测
• 3.8 小结
• 参考文献
• 第四章 液相色谱串联三重四极杆质谱定量分析地骨皮中的主要化学成分
• 4.1 药品与试剂
• 4.2 色谱与质谱条件
• 4.3 对照品溶液与样品溶液的制备
• 4.4 样品溶液制备方法的优化
• 4.5 色谱与质谱条件的优化
• 4.6 方法学验证
• 4.7 地骨皮中24个化学成分的定量分析
• 4.8 应用主成分分析法对不同产地地骨皮中化学成分的含量比较
• 4.9 小结
• 参考文献
• 第五章 地骨皮质量控制方法的建立
• 5.1 药品与试剂
• 5.2 地骨皮薄层鉴别方法的建立
• 5.3 地骨皮特征图谱的建立
• 5.4 地骨皮中lyciumins A和B的HPLC含量测定方法的建立
• 5.5 小结
• 参考文献
• 第六章 运用逆流色谱技术分离地骨皮中的环肽类成分的研究
• 6.1 试剂和材料
• 6.2 仪器
• 6.3 粗品的制备
• 6.4 分配系数（K）的测定
• 6.5 逆流色谱溶剂系统的配制和样品溶液的制备
• 6.6 逆流色谱分离过程
• 6.7 液相色谱分析条件
• 6.8 结果与讨论
• 6.9 小结
• 参考文献
• 第七章 结果与讨论
• 附录
• 致谢
• 个人简历
• 附件
• 学位论文自愿预先检测申请表