转基因充质干细胞微胶囊化试验研究

论文摘要

基于干细胞（stem cells）的组织再生技术是近年来研究的热点。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）属于未分化的成体干细胞,是良好的基因载体,可作为基因治疗的载体细胞。如将转BMP-2基因的MSCs细胞移植入宿主体内,可用于治疗骨折和骨缺损等。上海交通大学医学院将转染人BMP-2基因的自体骨髓间充质干细胞移植修复大鼠、兔、羊等动物负重长骨的节段性缺损,均获得初步成功。但病毒转染的细胞移植后对宿主有一定免疫原性,取自身细胞有风险,而进行异体、异种细胞移植需使用免疫抑制剂。若将具有免疫隔离平台作用的微囊化技术与基因重组间充质干细胞技术结合,可望为克服移植排斥反应和细胞来源缺乏等问题提供途径。即利用重组细胞的代谢产物调节机体生理功能,治疗相关疾病。本文对海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸（APA）微囊进行了改进,用新微囊体系包裹转BMP-2基因的MSCs细胞研究其成骨效应。主要进行了如下研究:1.传统APA微囊改进。利用纯化海藻酸钠制备的细胞微囊,细胞存活率高,微囊强度和生物相容性改善。海藻酸-壳聚糖微囊内MSCs存活率高于80%。载间充质干细胞海藻酸-壳聚糖-海藻酸（ACA）微囊制备工艺优化为:选用1.0～2.5×105分子量的壳聚糖、壳聚糖溶液的浓度为0.1%和壳聚糖覆膜时间7min。此外,利用聚乙烯乙二醇（PEG）对海藻酸钠体系微囊进行化学修饰。结果表明,化学修饰的微胶囊生物相容性改善。采用静电喷雾法制备了膜强度高的海藻酸钙-羧甲基纤维素钠液芯微胶囊。2.建立微囊化细胞动态检测新方法。Alamar Blue是一种无细胞毒性的活体染料,可用于连续检测细胞的增殖或代谢试验。Alamar Blue Assay的优点为:不用破坏微囊结构,无细胞毒性可以实现动态连续检测。Alamar Blue Assay是微囊内细胞增殖检测的有效方法。并利用alamar Blue Assay研究了化学修饰对微囊化细胞活力的影响。3.转BMP-2基因MSCs微囊化及其成骨效应的研究。转BMP-2基因MSCs微囊化后的蛋白渗透试验、MSCs成骨诱导以及ALP定量结果说明,微囊化MSCs具有活性能合成、分泌BMP-2且BMP-2能透过微囊且具有生理活性。微囊化转BMP-2基因MSCs不同种类鼠体内注射移植一月后,有新生骨组织形成。是骨组织工程化新方法。同时,微囊化基因重组干细胞技术开辟了基因治疗的新领域。

论文目录

• 英文缩略词一览表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 细胞微囊化技术概论
• 1.1.1 细胞微囊化研究进展
• 1.1.2 细胞微囊化方法
• 1.1.3 细胞微囊在生物医学领域的应用
• 1.2 细胞微囊制备材料
• 1.2.1 细胞微囊化常用材料
• 1.2.2 细胞微囊的生物相容性
• 1.3 立题背景及意义
• 1.4 本课题研究内容
• 第二章 纯化海藻酸钠在间充质干细胞微囊化中的应用
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 实验材料与试剂
• 2.1.2 实验仪器与设备
• 2.1.3 试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 MSCs 细胞培养
• 2.2.2 MSCs 细胞悬液制备
• 2.2.3 MTT 法测定海藻酸钠对间充质干细胞增殖的影响
• 2.2.4 MSCs 细胞微囊制备
• 2.2.5 微胶囊机械强度的比较
• 2.2.6 微囊化后细胞存活率测定
• 2.2.7 动物体内移植试验
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 海藻酸钠对间充质干细胞增殖的影响
• 2.3.2 微胶囊形态及机械强度
• 2.3.3 微囊化后细胞存活率的变化
• 2.3.4 动物体内移植后试验结果
• 2.4 本章小结
• 第三章 MSCs 海藻酸钠－壳聚糖微胶囊制备工艺优化
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 壳聚糖的纯化及其溶液制备
• 3.2.2 海藻酸钠－壳聚糖微胶囊制备
• 3.2.3 MTT 法测定壳聚糖溶液浓度对MSCs 活性的影响
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 不同种类及分子量壳聚糖的成囊性及对膜强度的影响
• 3.3.2 壳聚糖覆膜工艺的优化
• 3.3.3 载间充质干细胞海藻酸钠-壳聚糖微胶囊的制备
• 3.4 本章小节
• 第四章 海藻酸钠体系微胶囊的化学修饰
• 4.1 试验材料与仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 化学修饰的微胶囊的制备
• 4.2.2 MTT 法测定PEG 对MSCs 增殖的影响
• 4.2.3 alamar Blue Assay 测定化学修饰对微囊化MSCs 的活力的影响
• 4.2.4 体内移植观测化学修饰的微胶囊的生物相容性
• 4.3 试验结果与分析
• 4.3.1 化学修饰的胶囊形态
• 4.3.2 PEG 浓度对 MSCs 增殖及微囊化细胞活力的影响
• 4.3.3 ACP 微囊的生物相容性
• 4.4 本章小结
• 第五章 静电喷雾法制备液芯微胶囊研究
• 5.1 主要试验材料与仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 液芯微胶囊的制备
• 5.2.2 微胶囊粒径和膜厚的测量
• 5.2.3 液芯微囊制备工艺优化
• 5.3 试验结果与分析
• 5.3.1 海藻酸钠类型对成囊性的影响
• 5.3.2 喷雾针头直径对液芯微囊粒径的影响
• 5.3.3 磁力搅拌子形状对液芯微囊成囊性的影响
• 5.3.4 液芯微胶囊制备工艺优化结果与讨论
• 5.4 本章小结
• 第六章 转BMP-2 基因MSCs 微囊化及其成骨效应
• 6.1 试验材料与仪器
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 原代骨髓间质干细胞的分离培养
• 6.2.2 MSCs 细胞转染
• 6.2.3 ALP（Alkaline Phosphatase）染色及定量
• 6.2.4 动物体内移植试验
• 6.3 试验结果与分析
• 6.3.1 转BMP-2 基因MSCs 体内成骨效应
• 6.3.2 微囊化转MSCs 的体外BMP-2 的释放及活力测定
• 6.3.3 微囊化转BMP-2 基因MSCs 体内成骨效应
• 6.4 本章小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 展望与建议
• 7.2.1 展望
• 7.2.2 建议
• 参考文献
• 在读期间发表的论文和参加的科研项目
• 致谢