霉菌中C-N裂解酶的分离纯化及其酶学特性的研究

论文摘要

3-酮-井冈羟胺A C-N裂解酶是井冈霉胺生产中的三个关键酶之一,井冈霉胺是一种重要的医药中间体,被广泛应用与糖苷酶抑制剂的生产上。本文从一株能降解井冈霉素的霉菌出发,通过形态鉴定和18S rDNA分子鉴定,得出该菌种属于青霉属斜卧青霉。本文还考察了各种培养条件对3-酮-井冈羟胺A C-N裂解酶活性的影响,得出最佳碳源为井冈霉素A,最佳氮源为硫酸铵,最佳pH和最适温度分别为7.0和30℃。在最佳培养条件下,产酶能力能高了53%,培养时间缩短到5天。通过各种硫酸铵沉淀,离子交互层析,疏水层析等纯化手段,得到了电泳纯的纯酶,收率和相对酶活分别为32.2%和12.89 U/mg.经过SDS-PAGE凝胶电泳,测定纯酶的分子量为21.6 KDa。酶的最适pH和最适反应温度分别为7.5和40℃。酶的热稳定性比较差,在50℃下放置100分钟基本检测不到酶活。该裂解酶受到Hg2+,Ni2+,pb2+,Sn2+等金属离子的抑制,Ca2+能促进酶活,

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 蛋白质的分离纯化
• 1.1.1 蛋白质分离前的准备
• 1.1.1.1 缓冲液
• 1.1.1.2 盐、金属离子和螯合剂
• 1.1.1.3 还原剂和去垢剂
• 1.1.1.4 蛋白质的环境因素
• 1.1.1.5 蛋白酶抑制剂
• 1.1.2 蛋白质的提取和溶解以及浓度测定
• 1.1.3 离子交换层析
• 1.1.3.1 原理
• 1.1.3.2 载体（树脂）的选择
• 1.1.3.2.1 树脂的准备和层析柱的填装
• 1.1.3.2.2 样品的制备
• 1.1.3.2.3 缓冲液的选择
• 1.1.3.2.4 上样和洗脱
• 1.1.3.2.5 再生及保存
• 1.1.4 凝胶过滤层析（GF）
• 1.1.4.1 原理
• 1.1.4.2 载体（树脂）的选择
• 1.1.4.3 凝胶层析的一般步骤
• 1.1.4.3.1 凝胶的准备和层析柱的填装
• 1.1.4.3.2 上样及洗脱
• 1.1.4.3.3 再生和保存
• 1.1.5 亲和层析
• 1.1.5.1 疏水层析
• 1.1.5.1.1 原理
• 1.1.5.1.2 疏水作用层析的一般步骤
• 1.1.5.1.2.1 层析柱子的处理和填装
• 1.1.5.1.2.2 上样及洗脱
• 1.1.5.1.2.3 再生及保存
• 1.1.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.2 C-N裂解酶（E.C.4.3）
• 1.2.1 3-酮井冈羟胺 A C-N裂解酶的研究进展
• 1.2.2 异胡豆苷合酶
• 1.2.3 Deacetylisoipecoside合成酶和 Deacetylipecoside合成酶
• 1.2.4 酶活及产物检测方法
• 1.2.4.1 3-酮井冈羟胺 A C-N裂解酶的酶活测定方法
• 1.2.4.2 井冈霉烯胺、井冈霉胺的检测
• 1.3 本论文的选题意义及研究内容
• 1.3.1 本论文的选题意义
• 1.3.2 本论文的研究内容
• 参考文献
• 第二章 菌种鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂与仪器
• 2.1.4 菌种鉴定
• 2.1.4.1 丝状真菌鉴定依据
• 2.1.4.2 青霉属鉴定依据
• 2.1.4.3 18SrNDA序列的测定
• 2.1.4.3.1 菌株基因组 DNA的提取
• 2.1.4.3.2 PCR反应体系和反应条件
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 形态观察
• 2.2.2 18SrDNA分子鉴定
• 2.3 本章小结
• 参考文献
• 第三章 产酶培养条件的优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 试剂与材料
• 3.1.4 蛋白质含量的测定
• 3.1.5 粗酶液的提取
• 3.1.6 生物量的测定
• 3.1.7 碳源的选择和碳源浓度的影响
• 3.1.8 氮源的选择和氮源浓度的影响
• 3.1.9 初始pH对菌体生长和发酵产酶的影响
• 3.1.10 不同接种量的影响
• 3.1.11 摇床不同摇速的影响
• 3.1.12 溶氧的影响
• 3.1.13 发酵时间的影响
• 3.1.14 响应面法优化培养条件
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 碳源的选择和碳源浓度的影响
• 3.2.2 氮源的选择和氮源浓度的影响
• 3.2.3 初始pH对菌体生长和发酵产酶的影响
• 3.2.4 不同接种量的影响
• 3.2.5 摇床不同摇速的影响
• 3.2.6 溶氧的影响
• 3.2.7 发酵时间的影响
• 3.2.8 响应面法优化培养条件
• 3.3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 3-酮井冈羟胺 A C-N裂解酶的分离纯化及其酶学特性的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 主要实验仪器
• 4.1.2 主要实验试剂
• 4.1.3 菌种及培养方法
• 4.1.4 3-酮井冈羟胺 A C-N裂解酶酶活的测定
• 4.1.5 蛋白质含量测定
• 4.1.6 3-酮井冈羟胺 A C-N裂解酶粗酶液的提取
• 4.1.7 硫酸铵分级盐析
• 4.1.8 强碱性离子交换层析
• 4.1.9 疏水相互作用层析
• 4.1.10 电泳
• 4.1.11 酶蛋白分子量的确定
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 3-酮井冈羟胺 A C-N裂解酶的分离纯化
• 4.2.1.1 硫酸铵分级盐析
• 4.2.1.2 强碱性离子交换层析
• 4.2.1.3 疏水相互作用层析
• 4.2.1.4 酶纯度的鉴定和分子量测定
• 4.2.1.5 纯化总表
• 4.2.2 3-酮井冈羟胺 A C-N裂解酶的酶学特性
• 4.2.2.1 pH对3-酮井冈羟胺 A C-N裂解酶酶活性的影响
• 4.2.2.2 温度对3-酮井冈羟胺 A C-N裂解酶的影响
• 4.2.2.3 金属离子对酶活性的影响
• 4.2.2.4 产物浓度对酶活的影响
• 4.2.2.5 底物浓度对酶活的影响
• 4.3 本章小结
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 1 本论文的主要结论
• 2 本论文的展望
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文和专著