链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希菌多重PCR诊断方法的建立

论文摘要

链球菌（Streptococcus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（Salmonella spp.）以及大肠埃希菌（Escherichia coli）在自然界中广泛分布,对畜禽健康、食品安全、人类公共安全等都具有严重的影响,是引发人类和畜禽感染细菌性疾病的常见致病菌。对4种细菌引起的疾病的防治和流行病学调查,以及了解食品安全的现状和存在的关键问题都依赖于对病原的及时准确的检测和鉴定。因此,本研究针对NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌hut基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成四对特异性引物,通过优化PCR扩增条件建立了能同时检测四种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。对影响多重PCR反应的主要因素如退火温度和引物浓度等进行了适当的调整和优化,确定多重PCR的最佳退火温度为54℃,最佳引物浓度为0.4 pmol/μL;引物特异性分析表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希菌以及四种细菌的混合物中扩增出四条大小分别为197 bp、278 bp、495 bp和652 bp的特异性条带,但对其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对四种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6 pg、金黄色葡萄球菌33.2 pg、沙门氏菌35.7 pg、大肠埃希菌52.1pg,这样的敏感性远远高于传统的细菌分离培养检测方法。对人工模拟感染样本进行检测,多次检测结果表明该方法能从混合感染的病料中特异地检测出四种病原菌。建立的多重PCR方法特异性强,敏感度高,稳定性好,比传统的细菌学方法简便经济,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希菌的混合感染。经过进一步的研究和优化,可以考虑应用于兽医临床诊断以及食品安全的快速检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 动物安全问题现状
• 1.1.2 细菌性病原微生物的危害
• 1.1.3 动物病原检测的重要性
• 1.2 本文涉及的四种常见致病菌
• 1.2.1 链球菌概述
• 1.2.2 金黄色葡萄球菌概述
• 1.2.3 沙门氏菌概述
• 1.2.4 大肠埃希菌概述
• 1.3 致病菌检测方法的研究进展
• 1.3.1 传统检测方法
• 1.3.2 血清学检测方法
• 1.3.3 分子生物学方法
• 1.4 本研究目的及意义
• 第二章 试验研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要设备
• 2.1.4 实验动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌培养
• 2.2.2 模板提取
• 2.2.3 引物设计
• 2.2.4 PCR 检测方法的建立及条件优化
• 2.2.5 特异性试验
• 2.2.6 灵敏性试验
• 2.2.7 重复性试验
• 2.2.8 细菌培养物感染小鼠
• 2.3 结果
• 2.3.1 单项PCR 反应结果
• 2.3.2 多重PCR 条件的优化
• 2.3.3 多重 PCR 特异性试验
• 2.3.4 灵敏性试验
• 2.3.5 多重 PCR 检测人工模拟感染病料
• 2.4 讨论
• 2.4.1 引物的设计
• 2.4.2 多重 PCR 条件的优化
• 2.4.3 与传统检测方法的比较
• 2.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介