论文摘要
第一章清开灵注射液对小鼠免疫功能影响的体外研究目的：体外研究清开灵注射液（Solution of qingkailing，QKL）对小鼠T细胞活化、增殖、细胞周期，对腹腔巨噬细胞（Mφ）吞噬功能和一氧化氮（NO）的产生及对胸腺细胞凋亡的影响，探讨其对小鼠免疫功能的作用及机制。方法：利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术，检测T细胞早期活化抗原CD69的表达情况，分析QKL对未加刺激剂和刀豆蛋白A（Con A）刺激的T细胞早期活化的影响；用MTT、WST-1和羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）染色结合流式细胞术检测QKL对未加刺激剂和Con A刺激的T细胞增殖的影响；碘化丙锭（PI）染色结合流式细胞术分析QKL对未加刺激剂和Con A刺激的T细胞周期分布的影响；CFDA-SE标记的大肠杆菌（E. Coli）结合流式细胞术检测QKL对小鼠腹腔Mφ吞噬功能的影响；Griess反应试剂盒检测QKL对脂多糖（LPS）激活的Mφ产生NO的影响；PI染色结合流式细胞术检测QKL对小鼠胸腺细胞自发凋亡和地塞米松（DEX）诱导的细胞凋亡的影响。结果：QKL对未加刺激剂的T细胞的早期活化、增殖和细胞周期都没有明显影响，但对ConA刺激的T细胞行为有明显影响。ConA刺激12h后，T细胞表面CD69表达百分率为（63.12±3.07）％，终浓度为1／5120的QKL，有降低CD69表达的趋势，但与ConA相比，没有显著差异；加入1／1280的QKL后，CD69表达率降低至（56.24±2.43）％，与ConA对照相比，有显著差异；1／320和1／80的QKL，CD69表达率分别降低为（51.89±2.77）％和（39.09±1.39）％，与ConA对照相比，有极显著差异。QKL可抑制ConA刺激的细胞增殖，浓度为1／5120时，MTT和WST-1法测得的OD值及CFDA-SE法测得的增殖指数（Proliferation index，PI）与ConA刺激对照组相比，有显著差异，浓度高于1／2560时，与ConA对照相比，有极显著差异，三种方法检测QKL抑制ConA刺激的细胞增殖作用的EC50分别为：1／405.34、1／551.14和1／435.73；QKL对ConA刺激的细胞周期分布影响没有周期特异性，表现为：QKL增加ConA刺激的细胞中处于S期和G2／M期的细胞数目，降低处于G0／G1期的细胞数目，增加Sub-G1期细胞数目，但最高浓度时（1／160原液）G2／M期细胞降低，Sub-G1细胞明显增加；QKL可抑制Mφ的吞噬功能，表现为：未加药组Mφ吞噬CFDA-SE标记的E.Coli 2 h后，荧光强度明显增强，吞噬率为（61.33±2.45）％。加入终浓度为1／2700、1／900、1／300和1／100的QKL后吞噬率分别降低至（57.62±1.67）％、（53.55±2.30）％、（48.92±2.01）％和（39.32±0.68）％；QKL可以降低LPS激活的Mφ产生NO的量；对小鼠胸腺细胞的自发凋亡和DEX诱导的细胞凋亡都有显著的拮抗作用，与对照相比，均为P＜0.01。结论：OKL对小鼠免疫功能有多种调节作用：可有效抑制多克隆刺激剂诱导的小鼠T细胞的早期活化和增殖，对细胞周期分布也有明显影响，但没有周期特异性；可抑制腹腔Mφ的吞噬功能和激活后NO的产生，拮抗胸腺细胞的凋亡。结果提示QKL能有效抑制机体免疫功能，不仅对特异性细胞免疫功能有抑制作用，对非特异性免疫功能也有的抑制作用，这种免疫抑制作用可能是OKL临床治疗免疫相关疾病有效的基础。第二章清开灵注射液对正常、DTH和脓毒症小鼠的影响目的：第一章的体外实验初步证明了QKL的负向免疫调节作用，在此基础上，对处于三种不同免疫状态的小鼠，即正常小鼠、迟发型超敏反应（DTH）小鼠和脓毒症小鼠分别皮下注射QKL，观察其体内的免疫调节作用，并推测作用机制。方法：连续皮下注射QKL 5 d，通过检测小鼠体重、免疫器官指数和淋巴细胞对ConA刺激的反应，分析QKL对正常小鼠免疫功能的影响；采用二硝基氟苯（DNFB）诱发小鼠耳朵肿胀，发生接触性皮炎，建立DTH模型，通过比较QKL与NS对照对小鼠脾脏指数和发病耳肿胀抑制率评价QKL体内对小鼠的免疫调节功能；采用盲肠结扎穿孔术（CLP）后引起的多细菌性腹膜炎，建立小鼠脓毒症模型，通过观察QKL对小鼠存活状况的影响，评价QKL的免疫调节作用。结果：QKL有降低正常小鼠体重趋势，但与NS对照相比，未见明显差异；QKL可明显降低正常小鼠胸腺指数，但对脾脏指数没有影响；QKL用药组小鼠淋巴细胞体外对ConA刺激的反应能力明显降低。对DTH小鼠的影响为：与NS对照相比，QKL能明显减轻发病耳朵的肿胀率，降低脾脏指数。对脓毒症小鼠，QKL治疗组与NS对照相比，小鼠死亡率增加。结论：QKE降低正常小鼠胸腺指数和淋巴细胞对刺激剂的反应能力，减轻DTH反应，增加脓毒症小鼠的死亡率，表明QKL对机体免疫应答有抑制作用，其机制可能与QKL抑制T细胞和巨噬细胞功能有关。第三章清开灵注射液及其含药血清体外抑制HIV-1作用目的：探讨QKL及其药物血清体外抑制HIV-1的作用。方法：用MTT比色法检测QKL对H9／HIV-1ⅢB细胞(慢性感染HIV-1ⅢB的H9细胞)和MT-2细胞的毒性；采用荧光染料Calcein-AM标记的H9／HIV-1ⅢB细胞和系列稀释的QKL和药物血清作用后，与MT-2细胞混合培养，2 h后在荧光下计数融合细胞数目，评价QKL及其药物血清对早期细胞融合的影响；用MTT法检测QKL对HIV-1ⅢB感染细胞的保护作用；用HIVp24抗原试剂盒检测HIV-1感染MT-2细胞的培养上清p24抗原的含量，分析QKL对HIV-1复制的影响。结果：QKL对H9／HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞的CC50分别为1／50.76和1／36.97；抑制H9／HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞早期融合的EC50=1／235.29，SI=6.36；抑制HIV-1ⅢB细胞诱导MT-2细胞形成合胞体的EC50=1／198.02，SI=5.36；H9／HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞混合培养和HIV-1ⅢB感染MT-2细胞时，QKL保护病毒感染细胞免于死亡的EC50分别为1／166.67和1／144.93，SI分别为4.51和3.92；抑制p24抗原产生的EC50=1／175.44，SI=4.75；QKL药物血清也可抑制H9／HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞的早期融合，保护细胞免于死亡。结论：QKL及其药物血清体外有一定的抗HIV-1活性，作用机制可能是多靶点的，不仅可抑制病毒进入，还可抑制病毒的复制。
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