RhoA与2型糖尿病大鼠主动脉病变的关系及辛伐他汀干预的实验研究

论文摘要

目的:糖尿病大血管病变是对2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）患者危害最大的慢性并发症,它可以导致冠心病、脑血管疾病、四肢坏疽,致残致死率高。由多种细胞因子和炎性介质参与的非特异性炎症—动脉粥样硬化是其病理基础。小G蛋白RhoA是一类重要的细胞信号转导的中介分子,其主要作用是水解鸟氨酸。激活后的RhoA通过激活其下游靶分子—Rho激酶（ROCK）调节细胞的多种行为与功能,包括细胞骨架的组装、转录因子的激活、细胞周期的调节、平滑肌细胞的收缩迁移、细胞因子的分泌等。Rho蛋白都是在羧基末端被异戊烯化,通过这种异戊烯化作用引起活化的GTP结合形式的Rho蛋白移位到胞膜,继而和它的效应蛋白作用产生下游反应。Rho蛋白的异戊烯化可被他汀类药物抑制。以往对他汀类药物的调脂作用研究较多,但近年来已认识到他汀类药物具有独立于调脂作用之外的抗动脉粥样硬化的作用。本研究通过观察RhoA在大鼠主动脉中的表达,探讨RhoA在糖尿病大血管病变中的作用,并给予糖尿病大鼠辛伐他汀干预治疗,探讨其对糖尿病大血管病变的防治作用及作用机制。方法:从50只SD大鼠中随机抽取10只作为正常对照组（A组）,其余作为实验组。对照组喂以普通饲料,实验组喂以高糖高脂饲料。4周后再给予实验组大鼠STZ 30mg/kg腹腔注射。于实验第6周末选取空腹血糖（FBG）>7.8 mmol/L且伴有胰岛素敏感性降低者作为T2DM动物模型,并随机分为2组,即T2DM模型组（B组）、T2DM辛伐他汀治疗组（C组）。实验共持续14周。于第6周末心脏取血测定FBG、空腹胰岛素（FINS）水平,计算胰岛素敏感指数（ISI）。于第14周末心脏取血测定FBG与血脂。取大鼠主动脉,进行光镜（HE染色、Masson染色）、电镜观察,计算主动脉横截面病灶总面积与管壁总面积的比值;离体血管实验检测血管弹性;应用免疫组化方法检测RhoA在主动脉组织中的蛋白表达水平。使用计算机图像分析系统进行图像分析,计算RhoA的积分光密度（IOD）值。使用SPSS11.0统计软件处理实验数据,两组比较采用t/t’检验,组间比较采用方差分析,相关分析采用直线相关。结果1实验第6周末各项检测指标:注射STZ两周后,实验组大鼠FBG（12.99±1.16）mmol/L高于正常对照组（5.03±0.69）mmol/L （P<0.01）;FINS 18.79（18.23,19.29）mIU/L与正常对照组18.35（17.95,18.98）mIU/L比较无统计学差异（P>0.05）;ISI 0.0048（0.0045,0.0053）低于正常对照组0.0106（0.0103,0.0112）（P<0.01）,至此T2DM模型复制成功。2实验第14周末生化指标:A组大鼠FBG（4.96±0.92） mmol/L,B组大鼠FBG（13.15±1.18）mmol/L及TG、TC、LDL-C、VLDL-C水平均高于A组,HDL-C水平低于A组（均P<0.05）;C组大鼠TG、TC、LDL-C、VLDL-C水平均低于B组,HDL-C水平高于B组（均P<0.05）,FBG（12.70±3.54）mmol/L与B组比较无统计学差异（P>0.05）。3组织形态:HE染色显示,A组大鼠动脉内膜、中膜、外膜分界清楚,内膜光滑平坦,管腔面内皮细胞扁平完整,紧贴于平直的内弹性膜上,中膜弹性膜与平滑肌细胞平行整齐排列;B组糖尿病大鼠主动脉有不同程度的内膜增厚病灶,局部主要由排列紊乱的平滑肌组成,病灶表面内皮细胞肿胀,有的向腔面突起,有的脱落、甚至坏死,内弹力板局部厚薄不均或分层,中膜浅层平滑肌细胞增生,中层弹力板与平滑肌细胞间排列紊乱,可见隆起于内膜表面的增生性动脉粥样硬化斑块,表面为纤维组织,内膜下可见增生的平滑肌细胞断裂、巨噬细胞、泡沫细胞及细胞外脂质、基质;C组（辛伐他汀干预组）,大鼠主动脉内膜增厚较平坦,内皮细胞扁平,内弹力板较平直,中弹力板与平滑肌细胞之间较整齐相间排列,且有不同程度的血管平滑肌细胞增生,接近于正常大鼠动脉,可见少量的泡沫细胞,但无明显斑块形成。各组主动脉横截面病灶总面积与管壁总面积比值分别为:A组0.49±0.10%;B组0.91±0.06%;C组0.81±0.13%。B组较A组病变程度明显加重,C组较B组病变程度明显减轻,（均P<0.01）。相关分析表明主动脉病变程度与RhoA表达水平呈正相关（r=0.837,P<0.01）。Masson染色弹性、胶原纤维呈蓝色,胞质呈红色,细胞核呈蓝褐色,A组大鼠血管弹力膜较薄,弹性纤维分布均匀;B组大鼠弹力膜增厚,弹性纤维卷曲、排列紊乱,可见断裂,细胞外胶原纤维明显增多;C组大鼠血管弹力膜稍微增厚,可见较多的弹性纤维和胶原纤维。透射电镜下可见B组大鼠血管内皮细胞的部分细胞膜脱落,细胞质水肿,线粒体融合,大量线粒体有空泡现象,粗面内质网扩张、脱颗粒现象明显,游离核糖体数量明显减少。C组大鼠血管内皮细胞水肿,血管内皮下层增厚明显,厚薄不均,细胞膜缺失、破损。4离体血管实验:取大鼠胸主动脉离体灌流并通过生物信号采集系统记录张力变化,检测其对KCl、苯肾上腺素（PE）诱导的收缩反应,对乙酰胆碱（Ach）诱导的舒张反应。与A组比较,B、C组主动脉环对KCl、PE诱导的收缩反应明显增强（P<0.01）;对Ach诱导的舒张反应明显减弱（P<0.01）。与B组相比,C组主动脉环对KCl和PE的收缩反应明显减弱（P <0.01）,对Ach诱导的舒张反应明显增强（P<0.01）。5免疫组化染色:图像分析显示,B组大鼠RhoA蛋白表达的IOD值（788.21±13.29）是A组（272.95±18.44）的2.89倍,C组（592.83±71.87）比B组降低了25%（均P<0.05）。相关分析表明大鼠主动脉RhoA表达水平与FBG、LDL-C、VLDL、主动脉病变程度,及离体主动脉环对60 mmol/L KCl的最大收缩反应呈正相关（分别r=0.837、0.648、0.568、0.837和0.913,均P<0.01）,与HDL-C呈负相关（r=-0.781,P<0.01）。结论1动脉粥样硬化是T2DM大血管病变的主要病理基础。2 T2DM主动脉的收缩功能增强和舒张功能减弱。3 T2DM大鼠主动脉组织中RhoA蛋白表达增加,提示RhoA与糖尿病大血管病变的发生、发展存在密切关系。4相关分析表明糖尿病主动脉病变程度与RhoA呈正相关,提示针对RhoA及其抑制剂的研究有可能为T2DM大血管病变的防治提供新的理论依据。5辛伐他汀可能是通过调脂作用和抑制RhoA/ROCK信号转导通路,来发挥对T2DM大血管的保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 RhoA 与2 型糖尿病大鼠主动脉病变的关系及辛伐他汀干预的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述一 RhoA/ROCK 信号转导通路与糖尿病大血管病变
• 综述二 Rho与NAFLD纤维化
• 致谢
• 个人简历