论文题目: 鼠李糖脂合成酶Rh1A和Rh1B基因的克隆、表达、纯化及在石油微生物中的表达和应用研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 李清心
导师: 张长铠
关键词: 微生物采油,鼠李糖脂,鼠李糖脂合成酶,石油废水,石油降解,生物表面活性剂
文献来源: 山东大学
发表年度: 2005
论文摘要: 生物表面活性剂是一类含有亲水和亲油基团的物质,其中人们研究的较为详细的是鼠李糖脂。由于生物表面活性剂具有很好的乳化、助溶等效果,并且具有生物可降解性及无毒性,使其在微生物采油和其它应用中倍受重视,用微生物提高原油的采收率（MEOR）已成为一种极具应用潜力的技术。本论文旨在通过基因工程的方法,将铜绿假单胞菌的鼠李糖脂合成酶基因在石油微生物中进行表达,使受体菌获得高效产生生物表面活性物质（鼠李糖脂和烷基酰酸HAA）的特性,并将其应用于微生物提高原油的采收率或是环境污染物的处理等方面。 我们从大庆油田和长期被石油污染的土壤中取样,进行了菌种的分离,从中分离出了许多能以原油为碳源进行生长的菌株,也通过另外的方法筛选到了可以产生表面活性剂的菌株。在实验中发现许多菌株除了能以原油为碳源生长以外,还对原油有很好的降粘效果。经过菌种鉴定分析表明这些菌株主要是以假单胞菌（Pseudomonas sp.）和芽孢杆菌（Bacillus sp.）为主。对菌株的生化特性研究表明,不同的菌株对不同链长的烃的利用情况不同。而耐盐、耐温的实验表明大部分菌株可以在0—10%浓度的NaCl和60℃以下生长。经过质谱分析表明所筛选的一些菌株在以原油为碳源进行生长时,能够产生一些酸类物质,如丁酸等。而另一些菌株的发酵液能降低油水间的界面张力,通过表面活性剂的作用还可以降低原油的粘度。生物表面活性剂可以防止原油中蜡质的凝结,实验中发现L11菌株的发酵液对原油的防蜡率可以达到30%以上。 根据不同的应用目的,我们分别对菌株L11和DQ2的发酵条件进行了研究,确定了其最适的发酵条件,其中L11的发酵是为了获得大量的代谢产物表面活性剂,我们通过补糖和控制pH的方法,可以使L11的发酵液对油水的界面张力达到5.3×10-3mN/m。而DQ2的发酵条件的研究则是为了获得大量的菌体细胞,在此过程中我们建立了发酵终点的快速检测方法。同时,我们也确定了保存大量的L11和DQ2的发酵
论文目录:
摘要
ABSTRACT
本论文的缩写词表
第一章 石油微生物的研究现状与本论文的研究内容
1．1 自然界中碳氢化合物的来源
1．2 碳氢化合物的生物降解
1．2．1 碳氢化合物的好氧降解
1．2．2 碳氢化合物的厌氧降解
1．2．3 碳氢化合物对于细胞的毒害作用
1．3 油层中的石油微生物
1．4 利用微生物提高原油的采收率(MEOR)
1．4．1 MEOR方法的机理
1．4．2 MEOR的优点及局限性
1．4．3 利用生物表面活性剂进行采油
1．4．4 利用黄原胶来提高原油的采收率
1．5 目前石油开采行业所面临的问题
1．6 本论文的研究内容
第二章 菌种的筛选、鉴定及发酵条件的研究
2．1 材料和方法
2．1．1 菌种的来源
2．1．2 培养基的组成及配制
2．1．3 实验仪器
2．1．4 厌氧操作的方法
2．1．5 厌氧菌种的富集培养与分离纯化
2．1．6 石油降解菌的分离方法
2．1．7 产生生物表面活性剂菌株的初筛方法
2．1．8 菌种的鉴定
2．1．9 利用微生物进行原油的降粘实验
2．1．10 防蜡率的测定
2．1．11 界面张力的测定
2．1．12 表面张力的测量
2．1．13 生物表面活性剂的特性检测
2．1．14 生物表面活性剂的排油活性检测
2．1．15 乳化性能的检测
2．1．16 100L发酵罐的灭菌及接种
2．1．17 生物表面活性剂的初步定性及定量分析
2．1．18 发酵中菌体浓度的测定
2．1．19 发酵中葡萄糖的测定
2．1．20 发酵液中有机酸的测定
2．1．21 菌种的耐温、耐盐实验
2．1．22 菌液活性保存的研究
2．2 结果及讨论
2．2．1 菌种的筛选过程
2．2．2 菌种的筛选及鉴定结果
2．2．3 菌株的降粘性能的测试结果
2．2．4 部分菌株对不同烷烃的利用情况
2．2．5 菌株的耐温和耐盐的实验结果
2．2．6 几株菌在以原油为碳源的培养基中生长的生长曲线
2．2．6．1 菌株M3在生长过程中其发酵液的表面张力及pH值的变化
2．2．6．2 DQ2和M12在3号原油中厌氧培养的生长曲线
2．2．6．3 用质谱法定性分析菌株生长过程中所产生的有机酸
2．2．7 表面活性剂产生菌的筛选、鉴定及性能测试
2．2．7．1 菌种的筛选及鉴定
2．2．7．2 菌株培养液对原油的防蜡效果
2．2．8 菌种的复壮
2．2．9 复筛菌株的培养及发酵条件的研究
2．2．9．1 表面活性剂产生菌L11发酵培养基的确定
2．2．9．2 L11在发酵罐中发酵工艺的优化
2．2．9．2．1 在IL发酵罐中发酵时主要参数的变化
2．2．9．2．2 当用NaOH调节pH时，发酵液中各参数的变化情况
2．2．9．2．3 补入葡萄糖和调节发酵液pH后的IFT变化情况
2．2．9．2．4 L11在100 L发酵罐中的发酵情况
2．2．9．2．5 发酵液特性的检测
2．2．9．3 DQ2菌发酵条件的优化
2．2．9．4 菌体培养液保藏条件的初步研究
2．3 本章小结及展望
第三章 利用石油微生物处理石油废水
3．1 材料与方法
3．1．1 菌种
3．1．2 试剂
3．1．3 培养基
3．1．4 石油废水的来源
3．1．5 COD的测定
3．1．6 菌株对石油废水处理效果的检测
3．1．7 菌体浓度的测定采用显微计数法
3．1．8 菌体细胞的固定化
3．1．9 半连续法处理废水
3．1．10 连续处理废水
3．2 结果与讨论
3．2．1 菌种筛选
3．2．2 M12对不同废水的降COD的效果
3．2．3 不同的氮源对M12处理石油废水效果的影响
3．2．4 在不同的温度下M12对石油废水的降COD_(Cr)的效果
3．2．5 不同的接种量对M12处理废水效果的影响
3．2．6 固定化的M12寸石油废水的处理效果
3．2．7 利用固定化的菌体来半连续处理废水
3．2．8 麦水经M12处理后吸收光谱的变化
3．2．9 利用M12连续处理石油废水
3．3 实验小结
第四章 MEOR及其菌株16SrRNA的特异性检测
4．1 材料和方法
4．1．1 菌种的来源
4．1．2 菌种培养基
4．1．3 室内模拟提高原油的采收率实验
4．1．4 室内模拟驱油实验
4．1．5 室内的降粘率和防蜡率实验
4．1．6 原油的处理
4．1．7 细菌染色体DNA的提取
4．1．8 PCR扩增16SrDNA
4．1．9 16SrDNA的序列分析
4．1．10 特异性引物的设计
4．2 实验结果与分析
4．2．1 不同的培养条件对M3降粘率的影响
4．2．2 在室内条件下利用M3进行提高原油的采收率
4．2．3 利用DQ2提高原油的采收率
4．2．4 利用L11的发酵液提高原油的采收率
4．2．5 混合菌室内提高原油采收率的初步研究
4．2．6 进行微生物采油时对于目的菌株的快速检测
4．2．6．1 细菌中16SrRNA的序列确定
4．2．6．2 DQ2的16SrRNA序列的比较及特定引物的设计
4．2．6．3 利用菌落PCR来检测目的菌株的16SrRNA
4．3 讨论
4．3．1 单井吞吐试验
4．3．2 利用微生物进行防蜡的实验
4．3．3 利用16SrRNA 序列分析对MEOR菌株进行检测及鉴定
4．4 本章小结及工作展望
第五章 Rh1A和Rh1B的基因克隆、表达、纯化及在石油微生物中的表达和在MEOR中的应用
5．1 实验材料
5．1．1 药品及部分仪器
5．1．2 相关酶及抗体
5．1．3 实验所用的菌株
5．1．4 培养基
5．1．5 缓冲液及溶液
5．2 实验方法
5．2．1 细菌的培养及保存
5．2．2 大肠杆菌感受态细胞的制备
5．2．3 大肠杆菌的转化
5．2．4 细菌的电转化法
5．2．5 DNA浓度的测定
5．2．6 质粒的纯化
5．2．7 DNA电泳分析
5．2．8 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
5．2．9 PCR产物及酶切产物的纯化
5．2．10 PCR反应
5．2．11 PCR产物或质粒的酶切反应
5．2．12 DNA的连接
5．2．13 连接反应所得阳性克隆的筛选
5．2．14 重组蛋白的诱导
5．2．15 Western Blotting的实验过程
5．2．16 蛋白质的诱导
5．2．17 用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白
5．2．18 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
5．2．19 蛋白质浓度的测定
5．2．20 蛋白质样品的浓缩与脱盐
5．2．21 FPLC系统进一步纯化蛋白质
5．2．21．1 分子筛层析纯化目的蛋白RhlA
5．2．21．2 离子交换层析纯化目的蛋白Rh1B
5．2．22 红外光谱扫描分析蛋白质的结构
5．2．23 实验中所采用的分子量标准
5．2．24 细菌总RNA的提取过程
5．2．25 RNA浓度的测定
5．2．26 RT-PCR(反转录PCR)
5．2．27 鼠李糖脂的检测
5．2．28 HPLC系统纯化分析检测HAA
5．3 实验结果与分析
5．3．1 rh1ABR操纵子的结构
5．3．2 rh1A和rh1B的两种基因产物的部分特点
5．3．3 rh1AB的克隆及在大肠杆菌中的表达及纯化流程图
5．3．4 Rh1A和Rh1B的纯化流程图
5．3．5 rh1A基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化
5．3．5．1 rh1A基因的克隆及用菌落PCR来选择阳性克隆
5．3．5．2 Rh1A蛋白的表达与纯化
5．3．5．3 Rh1A重组蛋白的验证
5．3．5．4 Rh1A重组蛋白二级结构的检测
5．3．6 rh1B基因的克隆及在大肠杆菌中的表达及纯化
5．3．6．1 rh1B基因的克隆
5．3．6．2 Rh1B的表达与纯化
5．3．6．3 Rh1B蛋白活性的初步检测
5．3．7 基因工程菌的构建
5．3．7．1 酶基因rh1AB的转入对不同菌株产生鼠李糖脂的影响
5．3．7．1．1 用RT-PCR验证酶基因rh1A和rh1B的表达情况
5．3．7．1．2 各重组菌株鼠李糖脂的产生情况
5．3．7．2 Rh1A蛋白促进石油微生物HAA的产生
5．3．7．2．1 用Western Blotting检测rh1A的表达
5．3．7．2．2 用HPLC分析rh1A的表达产物HAA
5．3．8 所构建的工程菌在MEOR中应用的研究
5．3．8．1 重组菌株的发酵液对原油的降粘和防蜡效果
5．3．8．2 各重组菌株在室内条件下的MEOR实验
5．4 讨论
5．5 本章小结
第六章 本文小结
6．1 菌种的筛选、鉴定及发酵条件的研究
6．2 利用石油微生物处理石油废水
6．3 MEOR及其菌株16SrRNA的特异性检测
6．4 Rh1A和Rh1B的基因克隆、表达、纯化及在石油微生物中的表达和在MEOR中的应用
参考文献
致谢
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发布时间: 2005-10-17
参考文献
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