论文摘要
利用动物乳腺生物反应器来生产药用蛋白,是转基因动物的主要应用之一。转基因家畜乳腺生物反应器的研制周期较长,成本较高,因此在制作转基因家畜之前,对乳腺表达载体表达性能的验证是比较重要的。本试验在乳腺上皮细胞及转基因小鼠中对我们实验室构建的人乳铁蛋白基因乳腺表达载体（BLC14）进行验证,为制备转基因山羊乳腺生物反应器奠定基础。1. BLC14载体的组成:将山羊β-乳球蛋白基因调控序列,包括4.2kb的5`端和1.8 kb的3`端,人乳铁蛋白（hLF）cDNA,人巨细胞病毒（CMV）增强子序列及SV40 polyA序列和新霉素抗性筛选基因（Neor ）等基因元件体外重组构建成人乳铁蛋白基因乳腺表达载体BLC14。2.乳腺上皮细胞的培养:采用胶原酶和透明质酸酶共同消化法从健康的泌乳期山羊乳腺组织中分离到原代乳腺细胞;采用胰蛋白酶消化和反复贴壁法在DMEM/F12培养液中培养2-3代,获得纯化的乳腺上皮细胞。通过电转染法将表达载体BLC14导入纯化乳腺上皮细胞中,经G418筛选14d左右,获得59株抗G418的单克隆细胞株,对扩大培养的抗性细胞株进行催乳素诱导,收集诱导后48h的细胞上清液进行ELISA检测,结果显示8株G418抗性细胞株能够表达重组人乳铁蛋白,克隆表达率为13.6%。3.转基因小鼠制备:将BLC14构件的质粒用Sal1与Not1限制性内切酶消化,回收纯化约10.6kb的基因片段。注射PMSG和hCG使6-8周龄的C57♀超数排卵,与ICR♂进行交配后,获得受精卵1486枚,通过原核显微注射法将表达载体片段注射到小鼠受精卵雄原核中,注射后存活卵数（移植数）683枚,移植受体数26只,受体怀孕数10只,获得仔鼠46只,经过PCR检测,有4只（1♀,3♂）为转基因小鼠,整合率为8.69%。将转基因小鼠分别与正常小鼠交配,得到的后代经PCR检测,25号（♂）转基因小鼠的后代（F1代）中有6只为转基因小鼠,整合率为37.5%（6/16）;而11号（♂）转基因小鼠的后代（F1代）中未有基因整合小鼠。采用酶联免疫吸附法（ELISA）和蛋白印迹法（Western blot）对BLC14原代转基因小鼠乳汁中表达的重组人乳铁蛋白进行检测。ELISA检测结果表明在BLC14原代转基因小鼠（19号）的乳汁中人乳铁蛋白表达呈阳性,表达量约为1.5mg/mL。Western blot结果显示转基因小鼠乳汁中rhLF表达产物中有一个条带与标准人乳铁蛋白分子量相同,并且在20kD大小的地方还有另外一个条带。结果表明,本实验室所构建的BLC14载体能够在山羊乳腺上皮细胞中及转基因小鼠的乳腺中表达,从而证实了该载体不仅可以在体外培养的细胞中表达,还可以在动物个体乳腺中表达。从而预测了在转基因家畜（山羊）乳腺中表达的可能性,同时也表明,表达的山羊乳腺细胞作为供核细胞通过体细胞克隆获得具有乳腺表达性能的转基因山羊的可能性,为转基因家畜的制备提供依据。
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