Bacillus subtilis fmbJ产生的脂肽抗微生物效果及安全性评价

论文摘要

寻找新型更安全、环保的食品防腐剂和无残留、无耐药性的饲料添加剂是目前食品行业和畜牧行业的一个研究热点。近几年来，本课题组筛选到一株食品源的枯草芽孢杆菌fmbJ株，该菌株产生的抗微生物活性物质具有良好的热稳定性和部分酶稳定性，抗菌谱较广，抗微生物活性较高。目前研究表明该抗微生物活性物质主要为Surfactin和Fengycin，均为环状脂肽物质。与传统的食品防腐添加剂、饲料添加剂相比该脂肽物质具有抗菌谱广、对环境无污染、可生物降解、具有协同作用、不易产生耐药性、稳定性好、作用范围广等一系列的优点。同时随着人们生活水平的提高和对健康、长寿的重视，逐渐对一些可以直接或间接在体内蓄积的食品及饲料添加剂提出了更安全、更环保的要求。因此，开发天然的、安全的食品及饲料添加剂具有重要的意义。据此，本论文主要对该菌株产生的脂肽物质的抗微生物效果及安全性进行了研究，旨在为指导该脂肽合理应用及扩大应用范围提供理论依据和技术支持。得到以下研究结果：1．研究了该脂肽抑制大肠杆菌的敏感性及作用效果。结果表明大肠杆菌对其具有较高的敏感性，最小抑菌浓度为468.75μg／mL；菌体生长曲线、膜通透性、电镜研究表明其可以导致大肠杆菌细胞膜完整性被破坏，导致细胞内大分子泄漏，进一步导致菌体细胞破裂，并且无论是对生长期菌体细胞还是已经形成完整细胞壁的细胞均可以导致这一作用效果；此外，该脂肽还可以导致大肠杆菌细胞部分蛋白质合成受阻；能够和大肠杆菌染色体DNA体外结合导致DNA最大吸收峰的改变并产生减色效应及增色效应。最后，研究了其对已经形成完整细胞壁的大肠杆菌菌体细胞内膜、外膜通透性、呼吸代谢的影响，结果表明对其均有不同程度的影响。2．对该脂肽抑制蜡样芽孢杆菌的抑制作用从形态结构、生长繁殖、膜通透性、蛋白质合成等方面进行了研究，并且利用响应面法对其芽孢灭活效果进行了优化。结果表明蜡样芽孢杆菌及其芽孢对其具有较高的敏感性，最小抑菌浓度分别为80μg／mL和156.25μg／mL，能够较强的抑制蜡样芽孢杆菌生长繁殖；菌体生长曲线和电镜显微结构显示其对蜡样芽孢杆菌具有杀灭或溶解作用；透射电镜观察表明脂肽无论是对休止期的还是萌发期的芽孢均可以不同程度的导致其结构的异常变化，但对萌发期芽孢作用效果要强于未萌发的芽孢；利用吸光度法进行膜通透性研究，未发现明显的导致蜡样芽孢杆菌培养液中有大分子的紫外吸收物质的泄漏，但是通过电泳测定可以观察到有明显的核酸物质的泄漏；体外法研究脂肽和蜡样芽孢杆菌染色体相互作用表明其能够和染色体DNA体外结合导致染色体DNA最大吸收峰的改变并产生减色效应及增色效应。经响应曲面法优化后，在温度为29.6℃、作用时间为7.6h、浓度为3.46mg／mL的情况下可以将基质中的蜡样芽孢杆菌芽孢降低2个数量级。3．该脂肽对点青霉抑制活性研究表明：点青霉对其具有较高的敏感性，最小抑菌浓度为125μg／mL，能够较强的抑制点青霉的的生长繁殖及其孢子萌发；扫描电镜和透射电镜显微结构显示其对点青霉孢子具有溶解作用；并且可以显著降低琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶活性。此外，当脂肽作用于点青霉不同时间后可以导致细胞营养物质的吸收受阻或停止。4．利用体外培养的方法研究了该脂肽抗伪狂犬病病毒、猪细小病毒南京株、新城疫病毒lasota株、传染性法式囊病病毒H株的作用效果，并对其可能的作用途径进行了探讨。结果表明脂肽对PK-15细胞和CEF细胞的TD50分别为47.57μg／mL、128.95μg／mL；TD0分别为18.9μg／mL、25.79μg／mL；对PRV株、PPV南京株、NDV lasota株、IBDV H株所致细胞病变效应有明显的抑制作用，可使细胞存活率显著升高（p＜0.05）；对PRV株、PPV南京株、NDV lasota株、IBDV H株均有不同程度的钝化作用，并且对NDV lasota株、IBDV H株还具有一定的预防感染及抑制复制的作用；但是对于预防PRV株、PPV南京株在PK-15细胞上的感染及复制没有抑制作用。5．研究了该抗脂肽的食品安全性，为其应用提供了毒理学安全依据。依据GB15193-94《食品安全性毒理学评价程序和方法》进行急性毒性实验和30天喂养实验。结果表明昆明种小鼠一次经口灌胃量达5g／kg·BW，经一周饲喂观察未见有死亡和明显的表观中毒症状，屠宰观察肝脏、脾脏、肾脏未见有毒理性或病理性病变，肝脏指数、脾脏指数、肾脏指数也没有明显差异，但是在高剂量（大于1g／kg·BW）时会对小鼠生长产生影响。Wistar大鼠30天喂养实验结果表明，在剂量为250mg／kg体重的情况下，会导致大鼠血小板计数显著降低（p＜0.05），胆固醇含量显著升高（p＜0.05）。而对增重、饲料利用率、肝脏、脾脏、肾脏及其指数、其它的血液常规、生化指标均无显著影响。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写符号
• 表格索引
• 图形索引
• 前言
• 第一部分 文献综述部分
• 第一章 抗菌肽国内外研究概况
• 1.1 抗生素的发现及耐药性问题
• 1.2 抗菌肽的发现与发展
• 1.3 抗菌肽的优缺点
• 1.4 枯草芽孢杆菌产生的抗菌肽及其特性和作用
• 1.5 抗菌肽的生物活性及其作用机理
• 1.6 抗菌肽的应用
• 1.7 存在的问题及展望
• 1.8 本研究的目的意义及内容
• 参考文献
• 第二部分 试验部分
• 第二章 Bacillus subtilis fmbJ 产生的脂肽抑制大肠杆菌作用研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.3 本章小结
• 参考文献
• 第三章 Bacillus subtilis fmbJ 产生的脂肽抑制蜡样芽孢杆菌作用研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 Bacillus subtilis fmbJ 产脂肽抑制点青霉作用研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.3 本章小结
• 参考文献
• 第五章 Bacillus subtilis fmbJ 产脂肽体外抗病毒作用研究
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.3 本章小结
• 参考文献
• 第六章 Bacillus subtilis fmbJ 产生的脂肽安全评价
• 6.1 材料与方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.3 本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 创新摘要
• 致谢
• 攻读博士期间发表与投稿文章