野油菜黄单胞菌野油菜致病变种基因组中dctA基因的功能鉴定

论文摘要

碳素的吸收和利用是病原细菌在寄主植物的质外体成功定殖、扩展的基础之一。通常情况下,在植物质外体中葡萄糖的含量较低,病原细菌往往利用糖异生途径合成葡萄糖用于代谢。糖异生途径的底物大多属于四碳二羧酸,四碳二羧酸的吸收、转运、利用系统可能与病原细菌致病相关。四碳二羧酸(苹果酸,延胡索酸,琥珀酸,草酰乙酸)和四碳二羧酸类氨基酸天门冬氨酸转运主要依靠四碳二羧酸转运系统(Dct)。在野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株(Xcc 8004)基因组的功能注释中存在dctA、dctP和dctQ。本研究是在此基础上,通过生物信息学分析发现,除了dctA、dctP和dctQ之外还存在与dctB、dctD、dctM、dctS、dctR相似的四碳二羧酸转运相关基因,这表明在Xcc 8004中可能存在多个四碳二羧酸转运系统。本工作主要对这些系统中编码四碳二羧酸转运蛋白基因dctA进行了功能鉴定。我们利用pK18mob整合突变方法获得了dctA的非极性突变体,对该突变体的碳源利用能力检测表明,但dctA突变体在延胡羧酸羧酸为唯一碳源无碳源的基本培养基(noncarbohydrate minimal medium,NOM)平板上几乎不生长,而野生型在此条件下生长正常;而在苹果酸、琥珀酸上生长比野生型减缓。dctA突变体的致病相关生化因子检测发现与野生型没有显著差异,植株实验证明dctA基因与致病性无关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 细菌四碳二羧酸转运机理研究进展
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 细菌的四碳二羧酸的转运载体
• 1.1.2.1 四碳二羧酸转运家族
• 1.1.2.2 DctA载体
• 1.1.2.3 DctA相关基因的遗传学和调控
• 1.2 根瘤菌中的四碳二羧酸转运系统
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 共生与非共生状态下的根瘤菌对四碳二羧酸的利用
• 1.2.3 Dct调控系统
• 1.2.3.1 Dct系统的结构
• 1.2.3.2 DctA的结构
• 1.2.3.3 DctB和DctD双组份调控系统
• 1.2.3.4 DctA和DctB识别底物的机制
• 1.3 植物病原细菌Xcc的四碳二羧酸转运系统
• 1.3.1 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种
• 1.3.2 Xcc 8004中通过基因组注释发现的四碳二羧酸转运系统相关基因
• 1.4 本研究工作的目的、内容及意义
• 1.4.1 目的和内容
• 1.4.2 意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 抗生素和其它药剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 溶液与缓冲液
• 2.1.5 试材
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株培养条件及保存
• 2.2.2 三亲本接合
• 2.2.3 两亲本接合
• 2.2.4 PCR反应
• 2.2.4.1 引物设计
• 2.2.4.2 模板制备
• 2.2.4.3 反应体系
• 2.2.4.4 反应条件
• 2.2.4.5 PCR扩增产物检测
• 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.6 总DNA的提取
• 2.2.7 DNA的纯化和DNA的沉淀
• 2.2.8 限制性内切酶酶切
• 2.2.9 DNA片段的回收
• 2.2.9.1 试剂盒回收
• 2.2.9.2 透析法回收DNA片段
• 2.2.10 DNA连接
• 2.2.11 感受态细胞的制备
• 2.2.11.1 电脉冲感受态细胞的制备
• 2.2.11.2 CaCl2法感受态细胞的制备
• 2.2.12 转化
• 2.2.12.1 电脉冲转化
• 2.2.12.2 CaCl2法化学转化
• 2.2.13 质粒的提取
• 2.2.13.1 快速碱裂解法少量提取质粒DNA
• 2.2.13.2 质粒DNA的大量提取
• 2.2.14 植株的致病性试验
• 2.2.15 生长曲线的测定
• 2.2.16 被测菌在叶片中的生长状况
• 2.2.17 胞外多糖的检测
• 2.2.17.1 胞外多糖的平板检测
• 2.2.17.2 胞外多糖的摇瓶发酵检测
• 2.2.18 胞外酶的检测
• 2.2.18.1 胞外蛋白酶的检测
• 2.2.18.2 胞外淀粉酶的检测
• 2.2.18.3 胞外纤维素酶的检测
• 2.2.19 突变体碳源利用的检测
• 2.2.19.1 平板法
• 2.2.19.2 生长曲线检测法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 用生物信息学方法分析Xcc 8004中Dct系统的基因
• 3.2 dctA突变体
• 3.3 dctA非极性突变体的碳源利用检测
• 3.3.1 平板检测法
• 3.3.2 生长曲线检测法：
• 3.4 突变体菌株致病力与野生型没有显著差异
• 3.5 dctA基因的生化因子鉴定
• 3.5.1 摇瓶发酵检测胞外多糖
• 3.5.2 胞外酶和胞外多糖的平板检测
• 3.6 非极性突变体的功能互补
• 3.7 互菌株补的碳源利用检测
• 3.7.1 平板检测法
• 3.7.2 生长曲线检测法：
• 3.8 互补菌株致病力的统计学分析致病生化因子检测
• 3.8.1 互补菌株致性的分析
• 3.8.2 检测致病生化因子
• 第四章 讨论
• 4.1 Xcc中四碳二羧酸转运系统分析
• 4.2 dctA基因编码产物的功能预测
• 参考文献
• 致谢