论文摘要
干扰素-γ（Interferon gamma，INF-γ）又称Ⅱ型干扰素，是一种由活化的NK细胞和CD4+、CD8+等T淋巴细胞产生的细胞因子。无论在基因水平还是在蛋白质水平它都与Ⅰ型干扰素（如INF-α、INF-β）不同。它显示出低特异性的抗病毒活性，而具有更明显的免疫调节活性，所以也称为免疫干扰素；而白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）是最早发现的具有广泛生物活性的细胞因子，它能刺激T、B细胞的生长增殖，激活T细胞分泌IFN-γ、CSF等，增强Tc（cytotoxic T cell）、NK、巨噬细胞的细胞毒活性，增强抗原提呈作用，是机体免疫调节的重要细胞因子。我们根据GenBank上发表的山羊（Caprine）干扰素-γ和白细胞介素-2基因序列，设计了两套引物。应用RT-PCR方法从山羊外周血淋巴细胞中分别克隆了二者，将其克隆到pMD18-T载体中，经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析，表明扩增片段分别为山羊1FN-γ和IL-2基因。测序结果显示克隆的IFN-γ基因全长501个核苷酸，编码166个氨基酸，该基因与GenBank发表的山羊干扰素-γ基因序列（U34232）比较，核苷酸／氨基酸序列同源性为99.4％。经SignalP 3.0分析表明，前23个氨基酸为信号肽序列；IL-2基因开放阅读框架共有468bp，编码一条155个氨基酸的多肽，与GenBank发表的山羊白细胞介素-2基因序列（AF535145）比较核苷酸／氨基酸同源性为100.0％，与应琦华等的山羊IL-2序列的同源性为99.1％，前20个氨基酸为该蛋白的信号肽序列。应用DNA重组技术，将IL-2基因和去除信号肽的IFN-γ基因分别插入到原核表达载体pET-30a（+）的BamHⅠ和HindⅢ位点上，构建原核表达质粒pET30a-CapIL-2和pET30a-CapIFN-γ，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳，结果表明目的基因在大肠杆菌中以包涵体形式融合表达。分别用ProBondTM蛋白纯化试剂盒纯化，用所获得的重组蛋白纯化产物经三次背部皮下多点注射新西兰白兔，制备了兔抗山羊IFN-γ和兔抗山羊IL-2多克隆血清。经Western Blot鉴定，多克隆抗血清可与纯化的山羊重组蛋白发生特异性反应，说明重组蛋白具有抗原活性，为我们进一步研究它们的免疫治疗作用和免疫佐剂作用奠定了基础。