L.paracasei HD1.7 prcR定位突变及pMG36e对该菌的转化

论文摘要

Lactobacillus paracasei HD1.7是本实验室在2003年从乳酸酸菜发酵液中分离出的一株乳酸杆菌。在对其的研究中发现,该菌的发酵液中含有一种能够抑制多种革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌以及酿酒酵母的肽类物质,且该类物质的生成具有群体效应的特征。Jiro Nakayama et al.（2003）在L.paracasei E93490基因中发现了群体效应组件的身影,并阐明其信号分子可能具有抗菌活性。由此推测,在L.paracasei HD1.7中也有可能存在与L.paracasei E93490相同或相似的情况。至今为止,人们对L.paracasei该方面知之甚少,所以本研究具有非常重要的意义。参考现有的文献数据,本实验首先要通过PCR方法对实验菌株中的拟群体效应反应调节因子编码基因prcR的存在情况进行摸索,证实了该基因的存在。然后利用现代的生物信息学分析手段,对该基因片段的核苷酸组成,蛋白质构象等方面进行预测和对比分析,找寻prcR与其它已报道的反应调节子之间的联系。其次,以窄宿主范围的pUC18质粒为主体,构建可用于插入失活实验的自杀质粒pUC18-prcR-tet。在该质粒上,引入了四环素抗性基因做筛选标记,其上下游均有大约400bp的prcR片段作为同源重组的途径。电转化条件的摸索是将自杀质粒导入实验菌株的重要一环。本实验从感受态细胞的处理与制备,电击电压的大小以及复苏培养基的选择等方面对L.paracasei HD1.7电转化情况进行了探索,获得了最佳的电转条件:用含1%甘氨酸的MRS培养基培养的菌体,在A600为0.78时,经AEB1电转缓冲液处理后,在9kV/cm电压下完成电击,并迅速加入含10%蔗糖的高渗培养基中,复苏23h,即可达到最佳的电转化效果。最后,根据以上几方面的数据,通过电转化的途径,将自杀质粒pUC18-prcR-tet导入L.paracasei HD1.7,以期获得prcR基因敲除菌株。对能在Tet平板上生长的菌株进行PCR验证。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 细菌群体效应
• 1.1.1 细菌群体效应的发现和定义
• 1.1.2 细菌群体效应的机制
• 1.1.3 群体感应的研究方法与技术
• 1.2 副干酪乳杆菌（LACTOBACILLUS PARACASEI）群体效应研究概况
• 1.3 生物信息学概述
• 1.4 基因敲除技术概述
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试菌种和质粒
• 2.1.2 扩增引物
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要分子生物学及生化试剂
• 2.1.5 主要缓冲液及试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 L.paracasei HD1.7 细菌基因组的提取及浓度测定
• 2.2.2 prcR 基因的克隆及测序
• 2.2.3 测定氨苄青霉素、四环素和卡那霉素杀伤曲线
• 2.2.4 构建pUC18-prcR 质粒
• 2.2.5 克隆四环素（Tet）抗性基因
• 2.2.6 构建自杀质粒pUC18-prcR-tet
• 2.2.7 测定红霉素对L.paracasei HD1.7 的杀伤曲线
• 2.2.8 制备L.paracasei HD1.7 感受态细胞
• 2.2.9 pUC18-prcR-tet 和pMG36e 质粒电转化L.paracasei HD1.7 感受态细胞
• 2.2.10 prcR 基因敲除突变株的构建
• 第3章 结果与分析
• 3.1 L.PARACASEI HD1.7 细菌基因组的提取
• 3.2 PRCR 基因的PCR 扩增
• 3.3 生物信息学分析
• 3.3.1 ORF 分析
• 3.3.2 同源性分析
• 3.3.3 一级结构分析
• 3.3.4 二级结构和功能分析
• 3.3.5 三级结构预测
• 3.4 AMPIC、TET、KM 和EM 对L.PARACASEI HD1.7 的最小抑菌浓度
• 3.5 重组质粒PUC18-PRCR 质粒的构建
• 3.6 克隆TET 抗性基因
• 3.7 重组质粒PUC18-PRCR-TET 质粒的构建
• 3.8 甘氨酸（GLY）对L.PARACASEI HD1.7 细胞生长的影响
• 3.9 利用PMG36E 质粒摸索L.PARACASEI HD1.7 电转化条件
• 3.9.1 Gly 有无对电转化效率的影响
• 3.9.2 不同细菌生长时期对电转化效率的影响
• 3.9.3 不同的电转缓冲液对电转化效率的影响
• 3.9.4 不同电压对电转化效率的影响
• 3.9.5 高渗复苏培养基对电转化效率的影响
• 3.9.6 其它因素对电转化效率的影响
• 3.10 PRCR 基因敲除突变株的筛选与鉴定
• 3.10.1 prcR 基因敲除突变株的筛选
• 3.10.2 prcR 基因敲除突变株的鉴定
• 第4章 讨论
• 4.1 PRCR 基因的克隆
• 4.2 PRCR 基因生物学信息分析
• 4.3 PRCR 基因敲除载体的构建
• 4.4 L.PARACASEI HD1.7 电转化条件摸索
• 4.5 PRCR 基因敲除突变株的鉴定
• 4.6 工作设想
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢