冬小麦旱胁迫条件下叶片抗旱蛋白组的研究

论文摘要

随着淡水资源的匮乏和干旱逐年加剧,粮食生产受到的威胁也日益加剧,农作物抗旱节水研究受到国内外的高度重视。因此,抗旱节水研究为选育具有抗旱特性的小麦品种以及对小麦抗旱机理的研究奠定理论基础。已有学者对小麦幼苗期叶片中D-应答蛋白的表达进行研究,结果表明D-应答蛋白与小麦抗旱程度有关,但是小麦的抗旱性不是单一的,是多种蛋白相互作用或与环境互作的反应,为了发现更多与抗旱性相关蛋白,本实验将利用双向电泳对干旱胁迫处理小麦叶片进行蛋白质组学分析;为小麦抗旱机理的研究奠定理论基础;充分合理利用水资源,选育更具有抗旱特性的小麦品种。主要研究如下:（1）建立了一套适合于小麦叶片全蛋白的2-DE优化技术体系以抗旱性不同的冬小麦品种西农2208和西农189为材料,苗期经PEG胁迫处理后,比较分析了两种不同蛋白质提取方法TCA/丙酮法和磷酸钠缓冲液研磨法对IEF/SDS-PAGE双向电泳的影响,并在IPG胶条pH范围、蛋白质上样量和SDS-PAGE胶浓度等方面进行了探索与优化。结果表明,采用TCA/丙酮法提取叶片全蛋白可以降低RuBisCO酶的表达,更好的分离中分子量蛋白和低丰度蛋白的表达;选用17cm,pH4～7的IPG线性胶条能使蛋白质在等电点和分子量上得到较好的分离,在上样量为150g/胶条,12%SDS-PAGE胶浓度下进行双向凝胶电泳,蛋白质得到较优2-DE的图谱。利用该体系研究比较了PEG胁迫后双向电泳图谱差异,西农2208和西农189共有28个蛋白点存在差异,其中1个可信度较低;其它22个蛋白下调或下调,5个新诱导表达。（2）差异蛋白分析及功能鉴定为了在蛋白质水平揭示小麦抗旱胁迫分子遗传机制。用TCA/丙酮法提取叶片全蛋白样品采用固相IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术对小麦叶片全蛋白质进行了分离、银染,得到了重复性较好的双向电泳图谱。经PDQuest-DE软件分析识别出约290个较为清晰的蛋白质点,采用MALDI-TOF鉴定出的28个差异表达蛋白质,22个具有明显特异性蛋白,分别是:1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶、乙酰辅酶A羧化酶、查尔酮合成酶、5个未知蛋白、防御机制蛋白等。利用生物信息学功能与MEGA4.0软件对质谱鉴定蛋白质的氨基酸序列进行蛋白聚类分析,未知功能蛋白大多与卡尔文循环和糖酵解等有关,这些蛋白直接参与了小麦叶片内激素调节、光合、蛋白质转运、蛋白质互作、抗逆防御等,干旱胁迫诱导小麦叶片潜在基因表达,这些被表达的基因调控小麦抗旱蛋白的功能及其生理代谢过程。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 抗旱胁迫应答蛋白的研究进展
• 1.2.1 抗旱应答蛋白的种类及研究现状
• 1.2.2 旱胁迫应答蛋白的特性与信号转导
• 1.2.3 旱胁迫应答蛋白的功能
• 1.3 蛋白质组学的研究进展
• 1.3.1 蛋白质组技术及研究意义
• 1.3.2 蛋白样品制备方法研究进展
• 1.3.3 蛋白双向凝胶电泳技术
• 1.3.4 蛋白质质谱分析技术与功能鉴定
• 1.4 旱胁迫蛋白在蛋白质组学领域的研究进展
• 1.5 本论文的研究目的与意义
• 第二章 不同品种叶片全蛋白质SDS-PAGE 电泳分析及体系优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 仪器和试剂
• 2.1.3 叶片全蛋白提取与裂解
• 2.1.4 蛋白质含量的测定
• 2.1.5 小麦叶片全蛋白质的SDS-PAGE 电泳检测
• 2.1.6 双向凝胶电泳体系优化
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 蛋白质定量
• 2.2.2 单向SDS-PAGE 凝胶图谱比较
• 2.2.3 不同胶条pH 范围对2-DE 图谱的影响
• 2.2.4 不同蛋白质提取方法及SDS-PAGE 胶浓度对2-DE 图谱的影响
• 2.2.5 不同上样量对2-DE 图谱的影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 样品的制备
• 2.3.2 电泳条件的优化
• 2.3.3 小麦叶片抗旱差异表达蛋白
• 2.3.4 面临的问题
• 第三章 差异点蛋白组学分析与功能鉴定
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 双向凝胶电泳、染色、扫描、分析
• 3.1.3 差异蛋白质谱实验操作
• 3.1.4 生物信息学分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 小麦叶片全蛋白二维电泳图谱的建立及图谱分析
• 3.2.2 差异表达蛋白的MALDI-TOF-MS 分析及数据库检索
• 3.2.3 差异蛋白质理化性质分析
• 3.2.4 蛋白功能聚类及功能分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 两品种间抗旱性差异分析
• 3.3.2 实验结果分析
• 3.3.3 讨论
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.1.1 建立了一套适合于小麦叶片全蛋白的2-DE 优化技术体系
• 4.1.2 冬小麦不同品种叶片差异蛋白及功能的获得
• 4.2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介