獐牙菜苦苷生物转化研究

论文摘要

藏茵陈主要来源于龙胆科（Gentianaceac）獐牙菜属（Swertia）植物,该属植物多种中药、民族药及民间药均有长期治疗肝炎的临床背景。藏茵陈在《晶珠本草》、《四部医典》及《甘露本草明镜》等藏药经典著作中均有记载,主要功能为清热消炎、利胆退黄。主治各种热病,尤以治疗肝炎后高胆红素血症、急性黄胆肝炎、慢性肝炎而著称。獐牙菜苦苷是藏茵陈的主要活性成分之一。采用三株真菌:黑曲霉、米曲霉和康氏木霉及二株肠内菌:短乳杆菌和大肠杆菌对獐牙菜苦苷转化后发现,短乳杆菌和大肠杆菌对獐牙菜苦苷没有可见的转化作用;三株真菌均对獐牙菜苦苷起到了一定程度的转化作用,生成了三个产物。黑曲霉对獐牙菜苦苷的转化率最高,达到36%,米曲霉和康氏木霉次之,分别为15%和8%。獐牙菜苦苷转化液经分离、纯化得到两个转化产物,经过波谱解析鉴定为:（5Z）-5-ethylidene-8-hydroxy-3,4,5,6,7,8-hexahydro-1H-pyrano[3,4-c]pyridin-1-one（M1）和红百金花内酯（M3）。红百金花内酯是一个已知的活性化合物,具有保护皮肤细胞的作用;M1为一个新化合物。体外抗菌活性研究表明,M1对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有一定程度的抑制活性。黑曲霉培养液经硫酸铵沉淀、透析及DEAE-Sepharose凝胶柱分离、纯化,得到了一个与獐牙菜苦苷转化相关的β-葡萄糖苷酶。经测定此酶分子量约为88 KDa,最适pH 5.0-6.0,最适温度为50-60℃。在60℃以下有良好的热稳定性。Mg2+和Mn2+对此酶具有一定的激活作用,而Ca2+、Zn2+、Fe3+和Cu2+则能抑制该酶;ρ-NPG与纤维二糖是其合适的底物,獐牙菜苦苷次之;葡萄糖对该酶的抑制常数为0.25 mM,表明葡萄糖对该酶具有较强的抑制能力。转化条件优化结果表明,在变温培养条件下,产M1的最优转化培养基为MgSO4·7H2O 5.14 mg/mL,MnSO4·4H2O 3.42 mg/mL,葡萄糖9.95 mg/mL,蛋白胨9.24 mg/mL,pH 5.80,M1的最大转化产率为17.64 %;产M3的最优化转化培养基为:MgSO4·7H2O 4.09 mg/mL,MnSO4·4H2O 6.07 mg/mL,葡萄糖7.37 mg/mL,酵母膏7.37 mg/mL,pH 5.73,M3的最大转化产率为8.81 %。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 獐牙菜苦苷的来源及药理
• 1.2 药物微生物转化的方法
• 1.3 生物转化的特点
• 1.4 影响微生物转化反应的因素
• 1.5 用于生物转化的微生物菌株
• 1.6 獐牙菜苦苷生物转化研究进展
• 1.7 黑曲霉β-葡萄糖苷酶研究进展
• 1.8 本课题研究背景、内容及主要技术路线
• 第二章 獐牙菜苦苷的提取、分离和纯化
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 试剂材料
• 2.2.2 原料药材
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 獐牙菜苦苷提取分离流程
• 2.3.2 原料药的提取
• 2.3.3 大柱粗分
• 2.3.4 中柱细分
• 2.3.5 葡聚糖凝胶纯化
• 2.3.6 制备液相纯化
• 2.3.7 纯度测定
• 2.3.8 结构鉴定
• 2.4 结果
• 2.5 小结
• 第三章 獐牙菜苦苷转化菌株的筛选
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验仪器与试剂
• 3.2.2 转化菌株
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 转化方法
• 3.2.5 发酵液固相萃取
• 3.2.6 獐牙菜苦苷及其代谢产物的HPLC 检测
• 3.2.7 代谢产物分子量测定
• 3.2.8 獐牙菜苦苷转化率的估算
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 黑曲霉、米曲霉和康氏木霉对獐牙菜苦苷的转化结果
• 3.3.2 大肠杆菌和短乳杆菌对獐牙菜苦苷的转化结果
• 3.3.3 獐牙菜苦苷代谢产物分子量测定结果
• 3.4 小结
• 第四章 獐牙菜苦苷代谢产物的分离、纯化及结构鉴定
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.2 獐牙菜苦苷生物转化的放大
• 4.2.3 液-液萃取
• 4.2.4 半制备液相分离
• 4.2.5 结构鉴定
• 4.3 结果与讨论
• 4.4 小结
• 第五章 体外抗菌活性初步分析
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 药物及试剂
• 5.2.2 菌种及培养
• 5.2.3 供试药剂准备
• 5.2.4 琼脂扩散法测定药物抑制圈直径
• 5.3 结果与讨论
• 5.4 小结
• 第六章 黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料与方法
• 6.2.1 仪器与试剂
• 6.2.2 微生物菌株
• 6.2.3 培养基
• 6.2.4 实验方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.4 小结
• 第七章 獐牙菜苦苷转化条件优化
• 7.1 前言
• 7.2 实验仪器、试剂与方法
• 7.2.1 实验仪器与试剂
• 7.2.2 实验方法
• 7.3 单因素实验研究
• 7.3.1 不同浓度葡萄糖对β-葡萄糖苷酶活性及转化率的影响
• 7.3.2 不同碳源对β-葡萄糖苷酶活性及转化率的影响
• 7.3.3 不同氮源对β-葡萄糖苷酶活性及转化率的影响
• 7.3.4 不同初始pH 值对β-葡萄糖苷酶及转化率的影响
• 7.3.5 不同种类及浓度无机盐对β-葡萄糖苷酶及转化率的影响
• 7.3.6 不同培养方式对β-葡萄糖苷酶及转化率的影响
• 7.3.7 不同加样方式对β-葡萄糖苷酶及转化率的影响
• 7.3.8 獐牙菜苦苷加样浓度对β-葡萄糖苷酶活性及转化率的影响
• 7.3.9 不同培养时间对转化率的影响
• 7.3.10 数据统计分析
• 7.4 结果与讨论
• 7.4.1 不同碳源对β-葡萄糖苷酶活性的影响
• 7.4.2 不同氮源对β-葡萄糖苷酶活性及转化率的影响
• 7.4.3 不同初始pH 值对酶活及转化率的影响
• 7.4.4 不同培养方式对β-葡萄糖苷酶活性及转化率的影响
• 7.4.5 不同加样方式对转化率的影响
• 7.4.6 金属离子对β-葡萄糖苷酶活性及转化率的影响
• 7.4.7 葡萄糖对转化率及β-葡萄糖苷酶活性的影响
• 7.4.8 不同獐牙菜苦苷浓度对β-葡萄糖苷酶活性及转化率的影响
• 7.4.9 不同培养时间对转化率的影响
• 7.5 獐牙菜苦苷生物转化条件的统计优化
• 7.5.1 优化实验结果
• 7.5.1.1 Plackett-Burman 实验结果
• 7.5.1.2 中心组合设计实验结果
• 7.5.1.3 最优化转化条件预测
• 7.5.1.4 发酵罐小试验证
• 7.6 小结
• 第八章 总结与展望
• 8.1 全文总结
• 8.2 本文的创新点
• 8.3 不足之处及下一步工作建议
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文和科研情况
• 附录