抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对血小板功能的影响

论文摘要

研究背景及目的：动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是血管壁在受到氧化脂质或感染等各种因素损伤的基础上，发生的慢性炎症反应。而炎症反应与凝血系统激活在动脉粥样硬化病变的发生发展过程中起着至关重要的作用。重组融合蛋白TAP-SSL5是将能够特异性地与粒细胞表面的P-选择素糖蛋白配体-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）相结合，并能显著抑制粒细胞在含P-选择素（P-selectin）表面黏附的蛋白质SSL5（staphylococcal superantigen-like protein-5,金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5）作为引导兼功能分子，与能够抑制凝血因子Xa（factorXa, FXa）活性的分子―蜱抗凝血肽（tick anticoagulant peptide, TAP）进行融合而制备出的具有抗炎抗凝双效功能的融合蛋白。本课题组的前期研究表明， SSL5还能与血小板表面GPIbα结合，本课题进一步研究了融合蛋白TAP-SSL5对血小板功能的影响，旨在较全面地评价融合蛋白TAP-SSL5的功能。而OS-1是GPIbα的一种拮抗性多肽，能够抑制vWF-A1与GPIbα-Fc的结合，从而抑制血小板在激活血管内皮表面的黏附；本研究还进一步采用OS-1为对照，分析TAP-SSL5对体内血栓形成的影响。研究方法：1、构建融合蛋白TAP-SSL5表达载体：按本课题组前期已建立的方法，进行TAP-SSL5表达载体的转染以及该融合蛋白的纯化。2、体外实验部分：静脉血采自至少两周之内未服用过任何药物的健康志愿者，用枸橼酸钠（与全血的体积比为1:9）抗凝；进行离心后得到富含血小板的血浆（platelet-rich plasma，PRP），以1×Tyrode’s缓冲液平衡CL-2B琼脂糖凝胶柱后，将PRP以该凝胶柱过滤，得到凝胶过滤的血小板（gel-filtered platelets，GFP）。用流式细胞仪（FACS）检测融合蛋白TAP-SSL5和血小板结合的情况，并检测TAP-SSL5和OS-1对小鼠抗人GPIbα单克隆抗体（HIP1）与血小板结合的竞争性抑制作用；用流式细胞仪检测血小板表面CD62P的表达和PAC-1的结合量，以观察TAP-SSL5和OS-1对血小板的激活作用；采用Chrono-Log血小板聚集仪检测融合蛋白TAP-SSL5对全血（或PRP）血小板聚集的影响；并观察融合蛋白TAP-SSL5对血小板在纤维蛋白原表面静态黏附的影响。采用JC-1试剂盒和FACS检查，进一步研究了OS-1对血小板线粒体膜电位的影响，以期阐明OS-1对血小板功能影响的机制。3、动物实验部分：选取昆明小鼠，检测TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响。经尾静脉一次性注射不同剂量的TAP-SSL5，在距离小鼠尾尖5mm处截断，浸入温生理盐水中，记录出血时间；采用氯化铁诱导的大鼠下腔静脉血栓形成模型，研究OS-1的抗血栓形成作用。结果：1、融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合，并能竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合；终浓度为30mg/L的TAP-SSL5能激活血小板，使人血小板表面CD62P的表达和PAC-1的结合量明显增加，其阳性率分别为90.4%（p＜0.001）和66.3%（p＜0.01）；终浓度为10mg/L、30mg/L的TAP-SSL5均可引起血小板的显著聚集；30mg/L TAP-SSL5可促进血小板在纤维蛋白原表面的静态黏附；OS-1可抑制HIP1与血小板的结合；30μM OS-1可激活血小板，使人血小板表面CD62P的表达增加（阳性率39%）和PAC-1的结合量上升（阳性率40.5%）；而OS-1对血小板线粒体膜电位无明显影响。2、单次尾静脉注射10mg/kg的TAP-SSL5，能够显著延长小鼠尾部出血时间，由对照组的（647.1±33.7）s延长至（753.6±127.3）s（p＜0.01），而常规剂量组（3mg/kgTAP-SSL5）尾部出血时间为（612.8±79.1）s，与对照组相比无显著差异（p＞0.05）。采用氯化铁诱导的大鼠下腔静脉血栓形成模型的研究结果显示，DMSO溶剂对照组的血栓重量为（17.3±5.6）mg，单次静脉注射1.22mg/kg或3.66mg/kg的OS-1，可显著抑制FeCl3诱导的大鼠下腔静脉的血栓形成，血栓重量分别为（10.5±3.5）mg（与对照组相比，p＜0.05）和（8.2±4.1）mg（与对照组相比，p＜0.01）。结论：融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能，这提示TAP-SSL5可能通过抑制GPIbα与vWF的相互作用，而进一步增强其抗血栓作用；但TAP-SSL5与GPIbα的结合也可导致其在高浓度情况下激活血小板和延长出血时间。OS-1作为GPIbα的拮抗性多肽，可抑制氯化铁诱导的大鼠下腔静脉血栓形成，但同时对血小板也有一定的激活效应；体外研究显示，OS-1对血小板线粒体膜电位无明显影响，这提示OS-1与GPIbα结合后不会导致血小板凋亡。本课题研究主要评价了融合蛋白TAP-SSL5对血小板功能的影响，这些结果提示，具有抗炎抗凝作用的融合蛋白TAP-SSL5还具有针对GPIbα的拮抗作用，从而可能抑制血小板在高剪切力状态下的黏附。通过对GPIbα拮抗性多肽OS-1的研究，显示目前的GPIbα拮抗剂可能都具有一定的血小板激活效应。因此，研发无血小板激活作用的GPIbα拮抗剂，必将具有广阔的应用前景。

论文目录

• 英文缩写词一览表
• Abstract
• 摘要
• 前言
• 第一部分 抗炎抗凝双效融合蛋白 TAP-SSL5 对血小板功能的影响
• 材料与试剂
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 血小板膜糖蛋白 GPIbα拮抗性多肽 OS-1 对 FeCl3诱导的 SD 大鼠下腔静脉血栓形成的影响
• 材料与试剂
• 方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 图片
• 参考文献
• 文献综述 血小板膜糖蛋白 GPIbα拮抗剂的研究进展
• 参考文献
• 研究生期间发表和形成的论文目录