论文题目: 番茄乙烯受体基因LeETR1与LeETR2的功能特性及其组织、器官特异性比较研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 食品科学
作者: 王中凤
导师: 应铁进
关键词: 番茄,乙烯受体,反义表达,乙烯敏感性
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 为了探索LeETR1或LeETR2在番茄(Lycopersicon esculetum)乙烯受体基因家族中的功能特异性,构建了含有3’-端非编码区和35S CaMV启动子的反义LeETR1和LeETR2序列,以含反义LeETR1或LeETR2的表达载体转化番茄B1纯系,转化子经过多代筛选和鉴定,得到两个转基因株系ale1和ale2。将ale1与ale2杂交,得到杂交一代dale。以ale1、ale2和dale作为本实验的研究对象,经过标记基因NPTⅡ PCR、Southern blot分析、反义序列PCR和标记基因GUS活性鉴定均为阳性。证明转入的反义序列稳定遗传。对各株系生长发育、衰老脱落、果实成熟、乙烯合成、乙烯受体基因表达等进行了系统比较。结果如下: 1.ale1遮光幼苗上胚轴缩短增粗,自然光照下生长的植株明显矮化,显著性叶柄上位性生长,花序轴缩短,开花期和座果期都推迟,开花数和座果率下降,花朵衰老、花梗和叶柄脱落显著加速。这些性状提示乙烯受体LeETR1对番茄营养生长,生殖生长和器官衰老脱落都有重要调控作用。ale2只表现遮光幼苗上胚轴缩短、器官脱落加速和叶柄轻微的上位性生长等部分乙烯反应,提示乙烯受体LeETR2只在有限的组织中调控乙烯反应。 2.ale1果实在乙烯受体抑制剂1-MCP作用下,着色速度有所减慢;而在外源乙烯作用下,果实转色速度有所提高,提示ale1对外源乙烯和乙烯作用抑制剂敏感性提高。ale1果实果胶酶活性上升和硬度下降速度有所加快,提示乙烯受体LeETR1可能对调控果实硬度变化有一定作用。 3.转基因株系果实乙烯产量显著增加。自然后熟果实ale1和ale2乙烯产量分别是对照的3倍和5倍左右;外源乙烯处理果实ale1乙烯产量是对照的5倍,ale2和dale均是对照的2倍。转基因株系ACC含量明显高于对照株系,因此增加的乙烯产量可能与乙烯合成系统活性增强有关。 4.采用核酸酶保护分析法对乙烯受体基因家族表达模式进行了分析。在野生株系中LeETR1、LeETR2和LeETR4在转录水平的表达没有明显组织特异性,LeETR3和LeETR5主要在果实中表达,而在其它组织中很少。在转基因株系中,LeETR2在ale1离层、转色果和红熟果中表达有所增加,LeETR5在ale1果实中表达增加,提示LeETR2和LeETR5对LeETR1可能有组织特异的补偿作用。在转基因株系中相应的LeETR1或LeETR2 mRNA没有显著降低,转入的反义基因可能在转录后或者翻译水平发挥反义抑制作用,降低受体蛋白水平。 5.通过该项研究发现,番茄乙烯受体LeETR1与LeETR2在不同组织中可能有不同的相互关系。推测LeETR1和LeETR2在调控上胚轴生长上功能冗余,对器官脱落的调控既有功能冗余又有叠加效应。除此之外,在其它多项生长发育性状方面,ale1表现乙烯敏感性和乙烯反应增强,dale表现型与ale1基本一致,ale2则没有明显的增强乙烯反应性状,说明ale2在大多数组织中可能只是一个冗余存在的成员,没有直接的功能意义。LeETR1在番茄生长发育过程中对平衡乙烯反应可能具有特别重要的功能地位。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
插图和附表清单
符号与缩写
第一章 引言
1．1 项目来源与目的意义
1．2 乙烯对植物生长发育的意义
1．2．1 乙烯调节休眠和种子萌发
1．2．2 乙烯诱导三重反应并调控根、茎和枝叶的生长
1．2．3 增加雌花率
1．2．4 促进器官衰老与脱落
1．2．5 促进果实成熟
1．2．6 调控胁迫反应
1．3 乙烯生物合成的调控
1．3．1 ACC合成酶
1．3．2 ACC氧化酶
1．3．3 乙烯合成的反馈调控
1．4 拟南芥乙烯信号转导研究进展
1．4．1 乙烯信号转导线性模型
1．4．2 乙烯受体结构
1．4．3 乙烯受体对乙烯反应的负调控
1．4．4 乙烯受体与CTR1共同实现负调控
1．4．5 乙烯信号转导途径的正调控
1．5 乙烯与其它植物激素的相互关系
1．5．1 乙烯与脱落酸和生长素的关系
1．5．2 乙烯与其它植物激素的关系
1．6 番茄果实成熟突变体和乙烯信号转导研究进展
1．6．1 番茄果实成熟变体
1．6．2 番茄乙烯信号转导
1．7 反义RNA技术在植物基因工程中的研究进展
1．7．1 反义RNA在真核生物细胞中的作用原理
1．7．2 反义RNA在植物上的应用
1．8 本项研究工作基础与目标
第二章 反义LeETR1和LeETR2基因株系的鉴定
2．1 前言
2．2 材料与方法
2．2．1 标记基因NPT Ⅱ PCR鉴定
2．2．2 标记基因NPT Ⅱ的Southern blot分析
2．2．3 反义序列的PCR鉴定
2．2．4 β-葡萄糖苷酸酶(GUS)活性鉴定
2．3 结果
2．3．1 标记基因NPT Ⅱ PCR扩增结果均为阳性
2．3．2 转基因株系npt Ⅱ基因Southern blot结果
2．3．3 反义序列的PCR扩增结果
2．3．4 GUS活性鉴定结果
2．4 结论
第三章 乙烯受体LeETR1和LeETR2与番茄植侏生长发育的关系
3．1 前言
3．2 材料与方法
3．2．1 三重反应试验
3．2．2 成长植株形态特征调查
3．3 结果与分析
3．3．1 反义转基因株系遮光幼苗上胚轴缩短增粗
3．3．2 乙烯受体基因反义表达对株高和主茎的影响
3．3．3 叶柄上位生长特性
3．3．4 侧枝发育情况
3．3．5 开花和花序发育特征
3．3．6 开花期和座果率的变化
3．4 讨论
第四章 乙烯受体LeETR1和LeETR2与衰老和脱落的关系
4．1 前言
4．2 材料与方法
4．2．1 叶柄外植体脱落试验处理方法
4．2．2 花梗外植体脱落试验处理方法
4．2．3 花外植体衰老试验处理方法
4．2．4 乙烯和1-MCP处理方法
4．3 结果
4．3．1 叶柄和花梗外植体脱落
4．3．2 花朵衰老特征
4．4 讨论
第五章 乙烯受体LeETR1和LeETR2与果实成熟的关系
5．1 前言
5．2 材料与方法
5．2．1 果实呼吸强度测定
5．2．2 果实色泽测定方法
5．2．3 色素含量测定方法
5．2．4 果实硬度测定方法
5．2．5 果胶酶和果胶酯酶活性测定方法
5．3 结果
5．3．1 呼吸强度和乙烯释放量的变化
5．3．2 果实成熟过程色泽变化
5．3．3 果实成熟过程质地变化
5．4 讨论
第六章 LeETR1和LeETR2反义转基因番茄乙烯合成特性
6．1 前言
6．2 材料与方法
6．2．1 乙烯测定方法
6．2．2 花、叶乙烯释放量测定
6．2．3 果实成熟过程乙烯释放量测定
6．2．4 果实伤害乙烯测定
6．2．5 ACC含量和ACO活性测定方法
6．3 结果
6．3．1 花、叶乙烯产量
6．3．2 果实成熟过程乙烯释放量
6．3．4 伤害果实乙烯释放量
6．3．5 果实成熟过程ACC含量和ACO活性的变化
6．4 讨论
第七章 LeETR1和LeETR2反义转基因番茄的乙烯受体基因家族表达特性
7．1 前言
7．2 材料与方法
7．2．1 植物材料
7．2．2 RNA提取
7．2．3 探针合成的模板制备
7．2．4 探针合成与纯化
7．2．5 核酸酶保护分析操作
7．3 结果
7．3．1 RNA探针合成结果
7．3．2 LeETR1-LeETR5 mRNA表达丰度的RPA结果
7．4 讨论
第八章 总结与讨论
8．1 实验结果总结
8．2 乙烯受体表达与乙烯合成和乙烯反应的关系
8．3 乙烯受体家族成员结构差异与功能特性
8．4 乙烯受体基因家族成员表达时空差异与功能特异性
8．5 问题与新的研究方向
参考文献
致谢
作者简历
发布时间: 2005-07-15
参考文献
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- [4].钙对番茄乙烯生物合成和信号转导的调控机理及果实软化的影响[D]. 王文雅.中国农业大学2004
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- [6].番茄NR基因的转化和表达及相关的胁迫乙烯反应[D]. 杨静慧.中国农业大学2002