深海嗜压菌SS9中水通道蛋白基因的异源表达及生物学功能评价

论文摘要

水通道蛋白（AQP）对水具有极高的渗透性,有可能在仿生废水回收以及海水淡化等领域具有潜在的重要应用价值。本论文的研究目标是对来源于深海嗜压菌Photobacterium profundum SS9的潜在水通道蛋白基因（aqpSS9）进行在多种异源表达体系中进行表达,并分析其可能的生物学功能。首先利用生物信息学分析表明,AqpSS9肽链一级结构与大肠杆菌AqpZ的同源性高达67%,内含水通道蛋白的2个NPA保守序列,具有6个跨膜结构,从而具有强烈疏水特性,预测将整合在细胞膜上,有可能是一种新型的水通道蛋白。采用PCR方法从P. profundum SS9细菌基因组扩增得到AqpSS9的编码基因,构建成功表达载体pUC19-AqpSS9和pSJ2-AqpSS9,转化大肠杆菌,形成大肠杆菌MM/pUC19-AqpSS9和MM/pSJ2-AqpSS9。然后将这二种基因工程菌与AqpZ-改造菌MM1211（aqpZ-）在低渗条件下分别进行混合培养,以观察重组菌与改造菌的生长竞争现象。实验发现重组菌对改造菌有极明显的生长竞争优势,两者菌量比值最高可达32倍,从而间接鉴定了AqpSS9具有一定的水透过功能。进一步对AqpSS9在大肠杆菌中的表达条件进行优化。在优化了诱导条件（包括诱导时间、培养温度、IPTG浓度、诱导后培养时间）下,E.coli Rossetta（DE3）对AqpSS9的活性表达效率最高,AqpSS9表达量达48 mg/L。最后,为有效避免AqpSS9因强烈疏水性而导致的细胞毒性,论文采用适合于细胞毒性蛋白表达的Bac-to-Bac家蚕杆状病毒真核表达系统开展AqpSS9表达的研究。首先构建了重组穿梭载体Bacmid-AqpSS9,转染家蚕BmN细胞,发病后获得重组家蚕多角体病毒rBmAqpSS9。经过数代扩增,收获并保存适宜滴度的病毒储液,按感染复数MOI为5感染BmN细胞,最终成功表达了AqpSS9,表达量高达130 mg/L。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 水通道蛋白
• 1.1.1 水通道蛋白的结构
• 1.1.2 水通道蛋白的高渗透性
• 1.1.3 水通道蛋白的选择性
• 1.1.4 水通道蛋白在新型仿生废水回收领域的应用
• 1.2 深海嗜压菌Photobacterium profundum SS9
• 1.2.1 对海洋生物水通道蛋白的探索
• 1.2.2 Photobacterium profundum SS9
• 1.2.3 开发P.profundum SS9新型水通道蛋白的意义
• 1.3 水通道蛋白的功能测定
• 1.3.1 由细菌生长表型定性AQP功能
• 1.3.2 观察细胞体积变化定性AQP功能
• 1.4 水通道蛋白高效表达策略研究进展
• 1.4.1 大肠杆菌重组蛋白表达系统
• 1.4.2 家蚕杆状病毒表达系统
• 1.5 本课题拟研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 质粒、菌株与细胞株
• 2.2 工具酶与主要试剂
• 2.3 分子生物学相关操作
• 2.3.1 凝胶回收纯化DNA
• 2.3.2 大肠杆菌质粒的提取
• 2.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.4 转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.3.5 转化大肠杆菌转座宿主Bm-DH10Bac感受态细胞
• 2.3.6 重组Bacmid的小量制备
• 2.3.7 Bacmid转染BmN细胞及病毒扩增
• 2.4 SDS-PAGE
• 2.5 Western-blotting
• 2.6 主要仪器与设备
• 第三章 aqpSS9基因的生物信息学分析及重组载体构建
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 aqpSS9基因序列信息来源
• 3.2.2 生物信息学分析工具与软件
• 3.2.3 质粒与菌株
• 3.2.4 工具酶、试剂及分子生物学基本操作
• 3.2.5 aqpSS9基因的获得
• 3.2.6 重组载体的构建
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 基因序列信息
• 3.3.2 同源性分析
• 3.3.3 蛋白预测
• 3.3.4 功能位点预测
• 3.3.5 疏水性分析
• 3.3.6 跨膜结构预测
• 3.3.7 稀有密码子分析
• 3.3.8 重组载体的构建
• 3.4 小结
• 第四章 新型水通道蛋白AqpSS9的功能分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 质粒与菌株
• 4.2.2 工具酶与主要试剂
• 4.2.3 分子生物学基本操作
• 4.2.4 培养基与培养条件
• -）内AqpSS9的表达'>4.2.5 MM1211（aqpZ^-）内AqpSS9的表达
• 4.2.6 细胞裂解
• 4.2.7 细胞膜的分离
• 4.2.8 SDS-PAGE和Western-blotting
• 4.2.9 相对生长表型
• 4.2.10 菌落PCR
• 4.2.11 SDS-PAGE和Western-blotting
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 AqpSS9的表达和定位判断
• 4.3.2 MM/AqpSS9低渗环境中的相对生长型
• 4.3.3 菌落PCR
• 4.4 小结
• 第五章 大肠杆菌体系AqpSS9的表达及条件优化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 质粒与菌株
• 5.2.2 工具酶与主要试剂
• 5.2.3 分子生物学基本操作
• 5.2.4 培养基与培养条件
• 5.2.5 大肠杆菌常规宿主内AqpSS9的表达
• 5.2.6 细胞裂解
• 5.2.7 细胞膜的分离
• 5.2.8 SDS-PAGE和Western-blotting
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 选择最佳大肠杆菌宿主表达AqpSS9
• 5.3.2 诱导时间对8His-AqpSS9表达的影响
• 5.3.3 温度对8His-AqpSS9表达的影响
• 5.3.4 IPTG浓度对8His-AqpSS9表达的影响
• 5.3.5 诱导后培养时间对8His-AqpSS9表达的影响
• 5.4 小结
• 第六章 Bac-to-Bac家蚕杆状病毒系统有效表达AqpSS9
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验流程图
• 6.2.2 细胞株、菌株及质粒
• 6.2.3 工具酶与主要试剂
• 6.2.4 重组穿梭载体Bacmid-AqpSS9的构建
• 6.2.5 重组病毒rBmAqpSS9的构建
• 6.2.6 重组病毒rBmAqpSS9的扩增
• 6.2.7 AqpSS9在BmN细胞中的表达
• 6.2.8 SDS-PAGE和Western-blotting
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 重组穿梭载体Bacmid-AqpSS9的构建
• 6.3.2 重组病毒rBmAqpSS9的获得
• 6.3.3 AqpSS9在BmN细胞中的表达
• 6.4 小结
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 参考文献
• 作者简历