糜酶与肾素—血管紧张素系统在小鼠哮喘发病机制中的作用

论文摘要

目的支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎性细胞参与的慢性呼吸道炎症性疾病,是支气管平滑肌痉挛和支气管粘膜炎症所致的以小气道阻塞为主要特征的速发型变态反应性疾病。虽然对哮喘的发病机制和治疗的研究有很大进展,但哮喘的发病率、患病率和死亡率仍呈上升趋势。寻求对这类疾病的防治方法,一直是医学界探索的重要课题。因此,为找到有效的防治方法,人们从各种角度去探讨哮喘的发病机理。肾素-血管紧张素系统（Renin-Angiotensin System）是人体生理功能的一个重要神经内分泌系统,血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是RAS中最主要的效应分子,它主要通过作用于血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）,在循环系统或组织局部发挥收缩血管、调节血流、维持机体水盐代谢和促进组织细胞增殖的作用。除了上述作用,在机体病理状态下,AngⅡ在局部组织中还有重要的促炎作用。它可以调节炎症趋化因子、细胞因子和黏附分子等多种炎症介质的表达,促使炎症细胞聚集,参与机体炎症相关疾病的发生和发展。因此,RAS除了在心血管方面的调节功能以外,其与肺脏疾病的转归及预后的关系也已逐渐引起人们的重视。目前,虽然有报道认为RAS在哮喘疾病发生过程被激活,但实验结果只集中在RAS中的ACE与AngⅡ等方面的研究,不能解释哮喘机制研究中的某些现象。糜酶（chymase）主要是由肥大细胞分泌的中性蛋白酶,在多种组织器官炎症性疾病中参与作用。糜酶抑制剂除了可以抑制病变部位肥大细胞的聚集,还能有效抑制心肌梗死后心功能恶化、降低死亡率,并能降低动静脉内瘘以及人工血管移植后血管内狭窄的发生。随着实验研究的进展,我们发现,决定AngⅡ生成的调控机制,为理解RAS在肺疾病发生机制方面提供了新思路和新方法。有研究发现,血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）不仅可以由经典途径的血管紧张素转换酶（ACE）催化生成AngⅡ,糜酶作为另一条途径也可以催化AngⅠ生成AngⅡ。在哮喘发病过程中,以呼吸道慢性炎症性改变为主,其中可以看到大量肥大细胞参与整个气道炎症过程。有研究证实糜酶与呼吸系统疾病如肺脏组织纤维化等有关,但其与哮喘疾病的相关性还未见研究报道。因此我们推测,糜酶是否通过调节RAS,加重哮喘疾病过程中的炎症改变,在哮喘疾病发病过程中可能发挥一定的作用。因此,本实验制备BALB/c小鼠哮喘模型,应用血管紧张素转换酶抑制剂（卡托普利）和血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂（坎地沙坦）,分别阻断RAS活化的不同途径,减少AngⅡ生成或拮抗其与AT1R结合；利用糜酶抑制剂（Suc-Val-Pro-L-PheP（OPh）2）,以糜酶为靶点,观察小鼠哮喘时肺组织RAS系统相关组分蛋白及基因表达改变,以及肺脏组织形态学改变,进一步探讨RAS在哮喘发病过程中的作用。方法1.小鼠哮喘动物模型的制备及药物处理BALB/c小鼠80只,雌性,体重18-22g,随机分为8组：①对照组（A）,②模型组（B）,③卡托普利低剂量组（C）,④卡托普利高剂量组（D）,⑤坎地沙坦低剂量组（E）,⑥坎地沙坦高剂量组（F）⑦Suc-Val-Pro-L-PheP（OPh）2低剂量组（G）,⑧Suc-Val-Pro-L-PheP（OPh）2高剂量组（H）。除对照组小鼠外,其他7组小鼠从0、7、14天开始致敏,即腹腔注射混合液200ul/只（卵白蛋白（OVA）100ug/只,氢氧化铝凝胶2.25mg/只）。从第21天开始,连续七天雾化吸入5%OVA30min。观察小鼠,以烦躁不安,呼吸急促、腹肌抽搐、两便失禁等反应,作为判断模型动物症状阳性的指标。除对照组和模型组外,其他6组小鼠在雾化吸入开始前一天,每天灌胃相应剂量的各组药物,雾化吸入7天结束后,各组小鼠按实验设计要求,分别留取血清、肺组织等标本。2.HE染色和透射电镜观察各组小鼠肺脏组织形态结构变化,观察哮喘肺组织炎症浸润和结构破坏。3.免疫组织化学染色观察RAS中ACE、ACE2、AT1R、血管紧张素Ⅱ2型受体（AT2R）和糜酶等相关蛋白在哮喘肺组织中的表达变化。4. Western-blot法检测各组肺组织中RAS相关蛋白和NF-κB（p65和p50）的表达改变。5. RT-PCR检测各组肺组织中AGT, AT1R,AT2R和ACE等RAS相关基因表达的改变,分析哮喘疾病过程中相关基因表达及阻断RAS活化后,其变化的趋势。6.采用放免法测定AngⅠ及AngⅡ的含量,操作步骤按照试剂盒说明书进行结果1.肺组织形态学改变。肺组织HE染色结果可见：与对照组相比,模型组肺组织切片可见支气管周围及血管旁有嗜酸性粒细胞,肺泡巨噬细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润,气道上皮破坏,黏膜下水肿,支气管壁增厚,气道平滑肌增生,末梢肺泡组织过度充气等不同程度的炎性改变。卡托普利组、坎地沙坦组及Suc-Val-Pro-L-PheP（OPh）2组细支气管及血管周围肺脏组织中炎性细胞浸润明显减轻,黏膜上皮细胞脱落也有所改善,气道平滑肌痉挛、增厚和末梢肺泡组织气肿改变明显减轻。肺组织透射电镜结果可见：与对照组肺组织切片相比,模型组肺组织可见肺泡壁变薄,末梢肺泡过度充气；肺泡腔内嗜酸性粒细胞和中性粒细胞明显增多,肺泡巨噬细胞数目增多,肺泡壁和肺泡腔都有巨噬细胞分布,而且在较大的气管周围,肺泡巨噬细胞内溶酶体增多；肺泡壁Ⅱ型上皮细胞数量减少,体积变小,嗜锇性板层小体减少,胞质内可见线粒体,细胞表面微绒毛减少；肺泡隔内Ⅰ型上皮细胞脂滴减少。卡托普利低剂量组肺组织可见部分肺泡壁薄,结构不完全,肺泡腔内嗜酸性粒细胞,巨噬细胞和中性粒细胞增多,线粒体肿胀；Ⅰ型肺泡细胞状态较好,Ⅱ型肺泡细胞在肺泡壁薄的地方数目减少。卡托普利高剂量组肺组织可见,Ⅰ,Ⅱ型肺泡细胞较好,肺泡腔内嗜酸性粒细胞和巨噬细胞减少。坎地沙坦低剂量组肺组织可见肺泡壁炎症细胞增多,毛细血管闭塞,局部肺泡腔呈充血状；Ⅰ型肺泡细胞结构正常,Ⅱ型肺泡细胞胞质略致密,板层小体减少；肺泡隔内中性粒细胞增多,肺泡腔内可见较多巨噬细胞,嗜酸性粒细胞。坎地沙坦高剂量组肺组织可见Ⅰ、Ⅱ肺泡细胞结构趋于正常,Ⅰ型细胞胞质略致密,大部分Ⅱ型细胞结构正常,个别细胞胞质轻度致密,板层小体减少,肺泡腔内巨噬细胞,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞和淋巴细胞数量减少。Suc-Val-Pro-L-PheP（OPh）2低剂量组和高剂量组透射电镜结果可见,随着治疗剂量的增加,肺泡壁Ⅰ、Ⅱ型肺泡细胞结构和数量趋于正常,肺泡腔内和间质中浸润的炎症细胞数量较哮喘模型组明显减少,肺泡壁结构破坏减轻。2.AT1R免疫组织化学染色结果显示,对照组肺组织我们可见AT1R少量阳性表达,主要分布在毛细血管内皮细胞胞膜表面和胞浆中,局部组织未见明显炎症细胞浸润。模型组中AT1R阳性表达较对照组增加,肺泡上皮细胞内也有明显阳性表达,支气管壁周围炎性细胞浸润明显增多,管腔内可见脱落肺泡上皮细胞。Suc-Val-Pro-L-Phep（OPh）2组,卡托普利组和坎地沙坦组可以看到,随着各组药物剂量增加,AT1R阳性表达较模型组明显降低,肺组织炎症浸润明显减轻,支气管壁厚度明显小于模型组。ACE免疫组织化学染色结果显示,对照组肺组织中肺泡壁上皮细胞和血管内皮细胞胞浆中均有少量ACE阳性表达,模型组ACE阳性表达较对照组明显增加。卡托普利组随着药物剂量增加,ACE阳性表达较模型组明显减少。坎地沙坦组与Suc-Val-Pro-L-Phep（OPh）2组ACE阳性表达与模型组比较未见明显变化趋势。Chymase免疫组织化学染色结果显示,对照组chymase未见明显阳性表达,模型组在肺泡上皮细胞,细支气管及血管内皮细胞中均可见chymase阳性表达,较对照组明显增加,肺泡腔变窄,炎症细胞浸润增加。卡托普利组与坎地沙坦组随着药物剂量增加,chymase阳性表达逐渐减少,局部组织炎症浸润明显减轻。糜酶抑制剂组这种变化趋势更加明显,Suc-Val-Pro-L-Phep（OPh）2高剂量组可以明显抑制糜酶在肺组织中的表达。AT2R和ACE2免疫组织化学染色结果显示,在各组肺组织中,二者均未见明显阳性表达,各组间无明显变化趋势。3. Western blot检测各组肺组织RAS相关蛋白的变化。Western blot显示,模型组AT1R,ACE, chymase表达较对照组均明显增加,卡托普利组随着药物治疗剂量增加,上述三种蛋白表达与模型组比较明显降低,AT2R和ACE2蛋白表达在各组间未见明显变化趋势。坎地沙坦组随着药物剂量增加,AT1R和chymase表达与模型组比较明显降低,而AT2R、ACE和ACE2蛋白表达在各组间未见明显变化趋势。Suc-Val-Pro-L-Phep（OPh）2组随着药物剂量增加,AT1R和chymase蛋白表达较模型组比较明显降低,AT2R、ACE和ACE2蛋白表达在各组间未见明显变化趋势。NF-κB亚单位p65和p50在模型组中表达较对照组均明显增加,应用糜酶抑制剂Suc-Val-Pro-L-Phep（OPh）2后,二者在肺组织中的表达较模型组明显降低。4. RT-PCR检测各组肺组织RAS相关基因mRNA表达的变化。RT-PCR结果可见,在模型组,ACE mRNA表达较对照组明显增加,应用ACE抑制剂后,其表达较模型组明显降低,AT1R阻滞剂和糜酶抑制剂对其表达无明显影响。模型组AT1R mRNA表达较对照组明显增加,应用ACE抑制剂和AT1R阻滞剂后,其表达较模型组均明显降低,糜酶抑制剂对AT1R mRNA表达无明显影响。模型组AT2R mRNA的表达较对照明显降低,分别阻断ACE. AT1R和chymase后,均可使AT2R mRNA表达明显增加。AGT mRNA表达在各组间未见明显变化趋势。5.各组小鼠血清中AngⅡ与AngⅠ的含量变化本实验小鼠血清中AngⅡ与AngⅠ结果显示,模型组小鼠血清AngⅡ含量明显高于对照组,卡托普利组与Suc-Val-Pro-L-PheP（OPh）2组的小鼠血清AngⅡ含量与模型组比较明显降低。坎地沙坦组血清AngⅡ含量与模型组比较未见明显变化趋势。各组血清中AngⅠ的含量未见明显差异。结论通过本实验结果可以得出如下结论：1.肺组织形态学结果显示,模型组小鼠肺组织可见大量炎性细胞浸润,肺泡壁结构破坏,证明通过OVA腹腔注射致敏后再雾化吸入5%OVA,可以成功复制小鼠哮喘动物模型,并且是一种比较理想的哮喘动物模型。2.在小鼠哮喘发病过程中,RAS激活,其相关组分AngⅡ、ACE、AT1R和chymase等参与了哮喘肺组织的炎症过程,并加重局部炎症反应。AT2R在哮喘时可能起到对抗AT1R的作用,保护肺组织,减轻其炎症反应。3.哮喘时,通过抑制RAS活化,减少AngⅡ生成,减轻了肺组织炎症反应,进而可能使肥大细胞减少,下调了糜酶的表达。4.哮喘时,升高的AngⅡ与AT1R结合,激活胞浆内NF-κB,促其入核,转录合成大量促炎症释放因子,加重肺组织局部的炎症反应。抑制ACE、chymase和拮抗AT1R,能够减轻肺组织炎症变化。5.哮喘时chymase参与了RAS的激活,其作为RAS新成员,通过催化AngⅡ生成,成为哮喘疾病过程中的另一个重要促炎因素。糜酶抑制剂一方面可以通过抑制糜酶催化活性,使AngⅡ生成减少,减少NF-κB活化,同时也可能通过稳定肥大细胞,抑制其脱颗粒作用,减轻哮喘肺组织的炎症变化。因此,本研究成功复制小鼠哮喘模型,应用糜酶抑制剂抑制RAS激活,减轻小鼠哮喘模型肺组织炎症改变,阐明了糜酶与RAS在哮喘发病过程中的作用,即糜酶可能通过活化RAS,催化AngⅡ生成,参与了哮喘发病。这为临床研究和治疗哮喘疾病以及开发有效的治疗药物提供了重要的理论依据,使糜酶抑制剂有望成为治疗变态反应性疾病的一类新的药物。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 前言
• 第1章 文献综述
• 1.1 支气管哮喘
• 1.1.1 气道炎症形成机制
• 1.1.2 气道重塑学说机制
• 1.2 肾素-血管紧张素系统
• 1.2.1 血管紧张素原（AGT）
• 1.2.2 管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）
• 1.2.3 肾素（renin）
• 1.2.4 血管紧张素转换酶（ACE）
• 1.2.5 血管紧张素转换酶2
• 1.2.6 血管紧张素受体
• 1.3 糜酶
• 1.3.1 糜酶概述
• 1.3.2 糜酶的功能
• 1.3.3 糜酶在血管中的作用
• 1.3.4 从Ang Ⅰ到Ang Ⅱ的转换
• 1.3.5 糜酶在脉管系统的病理生理学功能
• 1.3.6 肥大细胞的稳定作用
• 1.3.7 糜酶抑制剂
• 1.3.8 血管疾病动物模型中的糜酶抑制剂
• 1.4 糜酶、肾素血管紧张素系统与哮喘
• 1.4.1 RAS与哮喘
• 1.4.2 NF-κB介导的肺组织炎症改变
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 肺组织蛋白裂解液
• 2.1.4 Western Blotting相关试剂
• 2.1.5 4%多聚甲醛溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验动物分组
• 2.2.2 小鼠哮喘模型的建立
• 2.2.3 小鼠肺组织标本采集
• 2.2.4 肺脏组织形态学检测
• 2.2.5 肺脏组织免疫组织化学染色
• 2.2.6 RT-PCR检测肺脏组织目的基因mRNA表达
• 2.2.7 Western-blot检测肺脏组织目的蛋白的表达
• 2.2.8 血清中Ang Ⅰ及Ang Ⅱ含量的测定
• 2.3 统计学处理
• 第3章 实验结果
• 3.1 肺组织形态学变化
• 3.1.1 肺脏组织HE染色光学显微镜观察
• 3.1.2 电镜照片观察各组肺组织结构变化
• 3.2 肺组织免疫组织化学染色观察RAS相关蛋白的表达变化
• 1R的免疫组织化学染色'>3.2.1 肺组织AT₁R的免疫组织化学染色
• 2R的免疫组织化学染色'>3.2.2 肺组织AT₂R的免疫组织化学染色
• 3.2.3 肺组织ACE的免疫组织化学染色
• 3.2.4 肺组织ACE2的免疫组织化学染色
• 3.2.5 肺组织chymase的免疫组织化学染色
• 3.3 Western-blot检测肺组织中RAS相关蛋白表达的变化
• 3.3.1 ACE抑制剂对RAS系统相关蛋白表达的影响
• 1R拮抗剂对RAS系统各组分蛋白表达的的影响'>3.3.2 AT₁R拮抗剂对RAS系统各组分蛋白表达的的影响
• 3.3.3 糜酶抑制剂对RAS系统各组分蛋白表达的的影响
• 3.3.4 糜酶抑制剂对NF-κB（p65/p50）蛋白表达的的影响
• 3.4 RT-PCR检测肺组织中RAS相关基因表达的变化
• 3.4.1 ACE抑制剂对RAS系统相关基因mRNA表达的的影响
• 1R拮抗剂对RAS系统相关基因mRNA表达的的影响'>3.4.2 AT₁R拮抗剂对RAS系统相关基因mRNA表达的的影响
• 3.4.3 糜酶抑制剂对RAS系统相关基因mRNA表达的影响
• 3.5 各组小鼠血清中Ang Ⅱ与Ang Ⅰ的含量变化
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的学术论文和科研
• 致谢