5-脂氧酶在脑缺血损伤后的脑内表达及其功能调节特点

论文摘要

5-脂氧酶（5-Lipoxygenase，5-LOX，EC 1.13.11.34）是催化花生四烯酸代谢成白三烯的关键酶。白三烯包括白三烯B4（LTB4）以及半胱氨酰白三烯类（cysteinyl leukotrienes，CysLTs，包括LTC4，LTD4，LTE4），是体内一类重要的炎症介质，介导平滑肌痉挛、微血管渗漏等反应，参与多种炎症性疾病的病理过程。5-LOX最早发现于外周组织，因而，早期对其病理意义的研究亦主要集中在哮喘、过敏性鼻炎等外周疾病。近几年的研究发现，5-LOX在中枢神经系统也有表达，参与脑缺血、脑外伤、脑肿瘤等中枢神经系统疾病的病变过程。脑缺血后，脑内5-LOX表达增加，其活性代谢产物白三烯亦显著增多；5-LOX抑制剂，如AA861、MK-886和去甲二氢愈创木脂酸（nordihydroguaiaretic acid，NDGA），对缺血性脑损伤具有保护作用。近来又有文献报道编码5-LOX激活蛋白（5-lipoxygenase activating protein，FLAP）的基因（ALOX5AP）可增加脑卒中的危险性。然而，另有研究发现，5-LOX基因敲除小鼠脑缺血后脑梗塞体积同野生型小鼠相比，没有明显差别。这种矛盾现象表明5-LOX功能的复杂性，其在脑缺血损伤中的作用需要进一步研究。另一方面，脑缺血是一个高度复杂的病理生理过程，可分成三个连续的过程：一是能量代谢障碍和兴奋性氨基酸毒性（急性期，几分钟到几小时）；二是炎症和凋亡（亚急性期，几小时到几天）：三是修复和再生（慢性期，几天到几个月）。脑缺血急性期和亚急性期的主要损伤特点，是神经元的凋亡和坏死；而脑缺血慢性期变化的特点，是反应性胶质细胞增生及胶质疤痕的形成。5-LOX如何调节在脑缺血急性、亚急性期及慢性期中的功能变化，仍不清楚，需要进一步研究。为了进一步阐明5-LOX在脑缺血损伤中的作用，本实验首先在大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral ischemia occlusion，MCAO）诱导的脑缺血模型上，观察脑缺血后14天内5-LOX表达和酶活性的时间和空间变化特点。我们将再灌注后3～24小时定义为损伤早期（包括急性期和亚急性期），再灌注后3～14天定义为损伤后期（包括亚急性期和慢性期）。然后，应用5-LOX抑制剂咖啡酸，分别研究了5-LOX与脑缺血后神经元损伤以及星形胶质细胞增生的关系；并在大鼠MCAO诱导的在体脑缺血模型及细胞缺糖缺氧（oxygen-glucose deprivation，OGD）诱导的体外脑缺血模型上，进一步应用5-LOX抑制剂，观察5-LOX在脑缺血中的功能变化特点。第一部分5-LOX在大鼠局灶性脑缺血后脑内表达及酶活性的时空变化特点目的：观察脑缺血后5-LOX在脑内表达及酶活性的时空变化特点。方法：MCAO 30分钟诱导大鼠局灶性脑缺血模型，观察脑缺血后14天内脑损伤的变化特征；同时应用RT-PCR、Western blot方法，观察脑缺血后5-LOX在脑内表达变化的时空特点；应用免疫组织化学及免疫荧光双标染色的方法，观察5-LOX在脑内的分布变化特点；应用酶联免疫法，测定脑缺血后5-LOX活性代谢产物白三烯B4（LTB4）以及半胱氨酰白三烯（CysLTs）在脑内的含量。结果：（1）RT-PCR及Western blot结果显示，在脑缺血中心区，再灌注12及24小时，5-LOX蛋白表达明显增高；24小时达峰值；然后降低，7到14天后回到基线水平。在损伤的周边区，5-LOX在再灌注3天内表达没有明显的改变，在再灌注7天明显增加并达峰值。（2）免疫组织化学和免疫荧光双标染色的结果显示，在缺血中心区，5-LOX免疫阳性细胞在再灌注12小时至3天明显升高，其中在再灌注24小时达峰值，主要表达在神经元。在缺血周边区，5-LOX免疫阳性细胞在再灌注24小时没有明显增多，在再灌注后3到14天开始逐渐增多，且主要表达在增生的星形胶质细胞。（3）5-LOX代谢产物白三烯的测定结果显示，在缺血侧皮层，再灌注后3小时CysLTs的水平明显升高，约为基线水平的15倍，并于再灌注后6小时至24小时持续维持此高水平，再灌注3天后恢复到基线水平，再灌注7天后再次升高，14天后又降低。另一方面，缺血侧皮层LTB4的水平在再灌注3小时轻微升高，但在再灌注后7至14天则明显升高。结论：（1）脑缺血后5-LOX mRNA及蛋白的表达明显上调，并且在时空分布特点上，表现为在脑缺血早期主要表达在缺血中心区的神经元，而在脑缺血后期主要表达在缺血周边增生的星形胶质细胞上。（2）5-LOX的活性代谢产物白三烯在缺血后脑组织内的含量变化呈双峰状，第一次高峰在脑缺血后3小时，CysLTs升高明显：第二次高峰在脑缺血后7天，LTB4升高显著。第二部分5-LOX在缺血性神经元损伤中的作用目的：在第一部分，观察到脑缺血再灌注24小时后，5-LOX主要表达于缺血中心的神经元。为了进一步阐明5-LOX对脑缺血早期神经元损伤的调节作用，本部分应用5-LOX抑制剂，观察其对脑缺血早期缺血性神经元损伤以及PC12细胞（神经元样细胞）缺血样损伤的作用。方法：以MCAO 30分钟，再灌注24小时建立大鼠局灶性脑缺血模型。在大鼠脑缺血前30分钟、再灌同时、再灌后1、2小时，腹腔注射5-LOX抑制剂咖啡酸10、50 mg／kg，观察5-LOX抑制剂咖啡酸对脑缺血早期损伤的作用，特别是其对神经元损伤的作用。同时，在OGD 2小时，复灌24小时诱导的PC12细胞体外缺血模型上，用MTT法和Hochest33258／PI染色法，进一步观察5-LOX抑制剂咖啡酸及齐留通对脑缺血损伤的作用。结果：（1）整体实验的结果表明，脑缺血30分钟再灌注24小时后，大鼠神经功能缺失明显，损伤侧脑组织水肿，神经元死亡，梗死灶形成。咖啡酸（50mg／kg）可改善大鼠神经功能缺失，保护缺血中心区的神经元，减小脑梗死体积，减少脑缺血／再灌注后3小时脑内5-LOX代谢产物CysLTs与LTB4的生成。（2）离体实验结果表明，OGD 2小时复灌24小时后，约有40％的PC12细胞凋亡，13％的细胞坏死。应用0.01，0.1，1μM咖啡酸处理后，PC12细胞的凋亡率减少到20％，且只有3％的细胞坏死。应用0.1～100μM齐留通处理后，PC12细胞的凋亡率减少到15％，坏死率降低到3％。结论：5-LOX抑制剂咖啡酸能减轻脑缺血／再灌注后神经元的损伤；5-LOX抑制剂咖啡酸和齐留通均可减轻缺糖缺氧诱导的PC12细胞缺血样损伤。提示5-LOX参与了脑缺血早期缺血中心区神经元的损伤。第三部分5-LOX在星形胶质细胞增殖中的作用目的：在第一部分，观察到脑缺血／再灌注后14天，5-LOX主要表达在缺血损伤周边增生的星型胶质细胞。为了进一步阐明5-LOX对脑缺血后期胶质细胞增生的调节作用，本部分应用5-LOX抑制剂，观察其对脑缺血后期胶质细胞增生的作用。方法：以MCAO 30分钟，再灌注14天建立大鼠局灶性脑缺血模型。在脑缺血再灌注后第一天分别在缺血前30分钟、再灌同时、再灌后1、2小时，腹腔注射5-LOX抑制剂咖啡酸10、50 mg／kg，并在再灌后第2到5天，每天腹腔注射两次。观察5-LOX的抑制剂咖啡酸对大鼠脑缺血后期变化的作用，特别是其对损伤周边区胶质细胞增生的作用。结果：脑缺血30分钟／再灌注14天后，缺血侧半球出现脑萎缩，并有明显的梗死灶；在损伤周边区的星形胶质细胞明显增多，且体积增大。5-LOX抑制剂咖啡酸（50 mg／kg）可减少脑梗死体积，减轻脑萎缩的程度，抑制损伤周边区胶质细胞的增生，减少脑缺血再灌注后7天脑内5-LOX代谢产物CysLTs与LTB4的生成。结论：5-LOX抑制剂咖啡酸对脑缺血后期脑损伤具有保护作用，可抑制脑损伤周边区星形胶质细胞的增生。提示了5-LOX参与了脑缺血后期损伤周边区胶质细胞的增生。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 5-LOX在大鼠局灶性脑缺血损伤后脑内表达及酶活性的时空变化特点
• 引言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第一部分小结
• 参考文献
• 第二部分 5-LOX在缺血性神经元损伤中的作用
• 引言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分小结
• 参考文献
• 第三部分 5-LOX在星形胶质细胞增殖中的作用
• 引言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分小结
• 参考文献
• 结论
• 综述 中枢5-脂氧酶的研究进展
• 一、5-LOX的分子生物学特性
• 二、5-LOX在中枢神经系统的分布和表达
• 三、中枢神经系统5-LOX表达的调控
• 四、5-LOX在中枢神经系统的生理功能
• 五、5-LOX与脑缺血
• 六、S-LOX作为中枢神经系统疾病药理干预靶点
• 七、结语
• 参考文献
• 已发表论文
• 致谢