人破骨细胞刺激因子的结构生物学研究及普通变形杆菌的LAD初步晶体学研究

论文摘要

(Ⅰ)破骨细胞是负责骨吸收的主要细胞。它的分化和成熟需要M-CSF（macrophage colony stimulating factor）和RANKL（receptor activator ofnuclear factor kappaB ligand）介导的信号通路网络。酪氨酸激酶Src,它参与了M-CSF和RANKL介导的信号网络,对破骨细胞的功能的发挥有重要作用。破骨细胞刺激因子（OSF）是由一个短的富含脯氨酸区域,一个SH3结构域和ankyrinrepeats组成的胞内蛋白,它可以间接地刺激破骨细胞的形成和活化。OSF在鼠中的同源蛋白SH3P2可以结合Cbl上的一段proline rich的区域并形成OSF-Cbl-Src的三蛋白复合物,说明它参与了Src和Cbl介导的信号通路。我们克隆、表达并纯化了人的OSF蛋白,并进行了晶体生长,在同一条件下获得了两种空间群的晶体,并解出了它们的结构。第一种晶型我们用多波长反常散射的方法解出了它的2.57（?）的晶体结构,它属于P212121空间群,晶胞参数为a=48.06 （?）,b=56.86 （?）和c=170.12 （?）,最后修正的R因子和Rfree因子分别为21.0%和28.4%。第二种晶型的结构使用分子置换法解得了1.95（?）得结构,它属于P1空间群,晶胞参数为a=28.31（?）,b=57.94 （?）,c=60.48 （?）,α=61.75°,β=76.53°,γ=90.08°,最后修正的R因子和Rfree因子分别为17.8%和23.8%。在最后的模型中,两种晶型都含有SH3结构域和ankyrin repeats结构域,只是结构域之间的相对位置有变化。这是第一个报道的具有SH3-ANKs这样的结构域排布顺序的结构。我们发现OSF-SH3结构域尾部的配体结合区（螺旋区域）明显与其它的SH3结构域不同,暗示它与proline rich配体之间的相互作用很可能需要构象的改变,并且这个构象的变化可能是受到后面的ankyrin repeats结构域的调控的。（Ⅱ）来源于普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶（LAD）可以催化多种L-氨基酸脱氨。在LAD的序列中发现存在保守的FAD结合区域,所以LAD可能是属于L-氨基酸氧化酶（LAAO）。我们构建了LAD的全长和氨基端29个残基缺失的△N29LAD质粒,表达并纯化了这两种LAD,并进行了晶体生长。我们得到了得到了△N29LAD适合衍射的晶体。我们收集了△N29LAD的一套2.9 （?）的数据,并进行了初步晶体学分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一篇 人破骨细胞刺激因子OSF的结构生物学研究
• 第一章 研究背景
• 1.1 引言
• 1.2 破骨细胞及其调控概述
• 1.2.1 破骨细胞简介
• 1.2.2 M-CSF和RANKL介导的信号调控
• 1.2.3 Src和Cbl在破骨细胞调控网络中的作用
• 1.2.4 自分泌因子在破骨细胞形成过程中的调节作用
• 1.3 破骨细胞刺激因子（OSF）的研究现状
• 1.3.1 OSF的发现、定位及分布
• 1.3.2 OSF的功研究现状
• 1.3.3 OSF蛋白的结构研究
• 1.4 SH3结构域和ANKs结构域的研究现状
• 1.4.1 SH3结构域的研究情况
• 1.4.2 ANKs的研究情况
• 1.4.3 同时含有SH3和ANKs结构域蛋白的研究
• 第二章 实验材料、设备和方法
• 2.1 实验材料与设备
• 2.1.1 菌株、质粒及培养基
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的蛋白的表达和纯化
• 2.2.2 蛋白理化性质研究
• 2.2.3 晶体生长与数据收集
• 2.2.4 晶体结构解析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 人OSF蛋白的表达、纯化
• 3.1.1 OSF基因测序
• 3.1.2 OSF蛋白的表达
• 3.1.3 OSF蛋白的纯化
• 3.1.4 质谱鉴定
• 3.1.5 相关理化性质测定
• 3.2 人OSF蛋白的初步晶体学研究
• 3.2.1 OSF晶体的生长
• 3.2.2 OSF衍射数据的收集及处理
• 3.3 晶体结构的解析及模型质量的分析
• 3.3.1 晶体结构解析
• 3.3.2 模型质量的评估
• 3.4 人OSF蛋白的总体结构
• 3.5 结构分析与讨论
• 3.5.1 OSF-SH3结构域
• 3.5.2 ankyrin repeats中可能的结合表面
• 3.5.3 人OSF与ASPP家族蛋白结构的比较
• 3.6 展望
• 本篇小结
• 参考文献
• 第二篇 普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的L-氨基酸脱氨酶（LAD）的克隆表达纯化及初步晶体学研究
• 第一章 背景介绍
• 第二章 实验设备、材料和方法
• 2.1 实验材料与设备
• 2.1.1 菌株、质粒及培养基
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒构建
• 2.2.2 目的蛋白的表达和纯化
• 2.2.3 晶体生长与数据收集
• 第三章 实验结果与讨论
• 3.1 表达载体的构建
• 3.1.1 引物设计
• 3.1.2 PCR扩增、酶切、连接及鉴定
• 3.2 LAD的表达和纯化
• 3.2.1 LAD的表达
• 3.2.2 LAD的纯化及浓度测定
• 3.3 LAD蛋白的晶体生长及优化
• 3.4 △N29 LAD晶体数据的收集
• 3.5 衍射数据处理
• 3.6 实验展望
• 本篇小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在读期间论文发表情况