论文摘要
人白介素24（Interleukin 24,IL-24）是在人黑素瘤细胞终末分化时,通过cDNA文库差减杂交时首先发现的,生化数据显示该蛋白具有细胞因子活性,属于IL-10基因超家族。研究显示IL-24对多种肿瘤细胞具有特异性的抑制生长和诱导凋亡作用,同时又能刺激免疫系统发挥免疫调节作用,因此成为肿瘤基因治疗的热点。为了进一步探讨IL-24对肿瘤细胞的作用及其可能的机制,本课题拟通过重组蛋白直接作用的方式或腺病毒转入基因的方式,研究人IL-24对人宫颈癌细胞株CaSki细胞的增殖和凋亡等的影响,并应用蛋白质组学技术对AdIL-24的作用机制进行初步探讨。第一部分白介素24原核表达载体构建及活性检测摘要目的:克隆人IL-24基因,构建原核表达载体,表达纯化GST-IL-24融合蛋白,检测其活性。方法:用密执毒素诱导宫颈癌HeLa细胞表达IL-24 mRNA,通过RT-PCR获取IL-24 cDNA,亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白质的氨基酸发生改变:A75T, H124Y,通过二次PCR将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,经GSTrapTMFF柱分离纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白表达。将CaSki细胞分为:PBS对照组、GST组、GST-IL-24组,通过MTT、流式检测GST-IL-24对宫颈癌CaSki细胞的作用。结果:获取人IL-24 cDNA,突变纠正后序列与GenBank公布序列（登录号:NM006850）完全一致,成功构建pGEX-IL-24原核表达载体,0.1mmol/L IPTG可以有效地诱导融合蛋白GST-IL-24以可溶性形式表达,融合蛋白的分子量约为50 kDa,可以显著抑制CaSki增殖:终浓度5mg/L,10mg/L,25mg/L,50mg/L纯化的GST-IL-24处理CaSki细胞72h后,MTT检测显示它抑制率分别为:18.1%,29. 1%,47.9%,56.1%,显著高于相应浓度的GST组,Annexin V流式细胞仪检测GST-IL-24组早期凋亡率明显高于其他各组（p<0.01）。结论:克隆得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,表达纯化得到GST-IL-24,该融合蛋白以剂量依赖的方式抑制CaSki细胞生长,促进凋亡。第二部分白介素24腺病毒表达载体构建及活性检测摘要目的:构建人白介素24腺病毒载体,获取病毒重组子,并研究其生物学活性。方法:以pGST-IL-24为模板,通过PCR扩增IL-24并将之克隆至pAdTrack-CMV载体,经Pme I线性化后,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在BJ5183菌中同源重组,HEK 293细胞包装扩增,PCR、Western blot鉴定。AdIL-24处理宫颈癌CaSki细胞,通过MTT、细胞存活实验检测其活性;Hoechst 33342染色、流式细胞仪检测凋亡。结果: pAd-IL-24经Kpn I和Xho I双酶切后可见9kb和650bp左右的条带,证明构建成功。重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后可见一条4.5kb和一条约30kb的条带,表明同源重组成功。线性化同源重组的腺病毒,转染293细胞,于荧光显微镜下可见绿色荧光表达,Western Blot检测表明有目的蛋白表达。MTT结果显示:AdIL-24以剂量依赖的方式明显抑制CaSki细胞增殖。细胞存活分析实验表明可以明显抑制癌细胞的长期活力。Hoechst 33342染色结果显示AdIL-24处理的CaSki细胞:核着色变深、固缩、碎裂、出现典型的凋亡小体,而对照组细胞形态学没有明显变化。流式细胞仪检测结果显示: AdIL-24（100pfu/cell）处理CaSki细胞48h后,细胞凋亡率为33.58±3.31,相比Advec组（2.63±0.63）和PBS组（2.32±1.42）有明显的统计学差异（P<0.01）。结论:成功构建人IL-24的重组腺病毒载体,其病毒重组子具有生物活性。第三部分AdIL-24抑癌机制的蛋白质组学研究摘要目的:利用蛋白质组学方法探讨AdIL-24对宫颈癌CaSki细胞作用的分子机制。方法:通过双向凝胶电泳分离AdIL-24处理前后细胞总蛋白,并对胶条（pH3-10NL,pH4-7）、SDS-PAGE浓度（10%,12%）、电泳时间（6h,7h）进行优化,PDQuest图像分析, MALDI-TOF质谱鉴定, MS-fit和Mascot软件查询SWISS-PORT蛋白质数据库,半定量RT-PCR检测p53、BAX、AK1、GADD45γ、BCCIP、eIF-5A mRNA水平变化,Western blot在蛋白质水平对p53、BAX进行验证。结果:获得分辨率高、重复性好的CaSki细胞双向电泳图谱,图像分析显示有43个蛋白斑点表达有差异,经MALDI-TOF检测,鉴定了29个可能蛋白,15个上调表达（p53、BAX、AK1、GADD45γ、BCCIP等）,14个下调表达（eIF-5A、Protein DJ-1、Annexin V等）。AdIL-24处理后p53、BAX、AK1、GADD45γ、BCCIP的mRNA表达上调,而eIF-5A mRNA表达下调。p53、BAX蛋白质在AdIL-24处理后表达上调。结论:AdIL-24处理前后有多种蛋白质差异表达,这些蛋白质参与细胞的增殖、分化、凋亡等多种信号通路,提示这些蛋白质可能参与AdIL-24的抗肿瘤作用。