论文摘要
目的:以我们从临床分离的我国第一株分泌碳青霉烯酶OXA-72的鲍曼氏不动杆菌菌株为模板,在毕赤酵母表达系统中重组表达并分离纯化碳青霉烯酶OXA-72,并测定其等电点,为进一步研究碳青霉烯酶OXA-72的结构、功能和性质奠定基础。方法:使用E-test药敏纸条检测12种抗生素对鲍曼氏不动杆菌菌株40的MIC。提取鲍曼氏不动杆菌菌株40的总DNA,以之为模板,用目的引物P1、P2进行PCR,扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物经EcoRI和KpnI双酶切、回收,连接双酶切后的pGAPZαA,得到重组质粒pGAPZ-oxa72,转化E coli DH5α,得到E coliDH5α（pGAPZ-oxa72）,扩增后提取重组质粒pGAPZ-oxa72,以之为模板,用载体引物进行PCR,扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测;并对重组质粒进行双酶切和测序鉴定。用AvrⅡ酶切重组质粒pGAPZ-oxa72使之线性化,然后电击转化入GS115酵母细胞中,利用含Zeocin的YPDS平板筛选阳性转化子。同时以AvrⅡ线性化的不含oxa-72的空质粒pGAPZaA电转化GS115作对照。提取酵母基因组DNA,以之为模板,用目的引物和载体引物分别进行PCR,以验证阳性克隆GS115（pGAPZ-oxa72）和GS115（pGAPZαA）。采用超声法破碎培养72h的阳性克隆GS115（pGAPZ-oxa72）和GS115（pGAPZαA）的菌体,然后离心取上清,用His tag antibody做western blotanalysis。用含有高浓度Zeocin的YPD平板二次划线筛选阳性克隆,挑取单克隆至5ml培养液中,30℃、220rpm震荡培养72h,离心,将上清转移至新EP管中,用等体积YPD培养基重悬菌体,分别向菌体溶液和上清中滴加一滴头孢硝噻吩,观察溶液颜色的变化,同时以GS115（pGAPZαA）菌株和GS115菌株做对照。采用镍琼脂糖凝胶柱色谱分离重组蛋白。缓冲液平衡镍柱后将20ml细胞破碎液上样,再用缓冲液洗柱后,分别用50mM和200mM咪唑缓冲液进行阶段洗脱,收集各阶段洗脱峰,SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色检测重组蛋白的分子量大小和纯度。委托北京蛋白质组研究中心对纯化所得的OXA-72蛋白冻干粉进行等电聚焦电泳,以测定重组蛋白质的等电点。结果:菌株40的亚胺培南和美罗培南的最低抑菌浓度（MIC）均为32μg/ml,此外还对头孢噻吩、头孢哌酮、羟氨苄青霉素和羟氨苄青霉素-棒酸（2/1）耐药。1%琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增得到约843bp的oxa-72基因,且未见非特异性扩增条带;用载体引物进行PCR扩增pGAPZ-oxa72,得到的片段长度约为1340bp;双酶切pGAPZ-oxa72得到约840bp和约3kb的两片段,与预期一致;用载体引物对pGAPZ-oxa72测序,将测序序列blast显示克隆的oxa-72基因与Genbank中oxa-72基因序列（GenBank accessionnumbers AY739646）相似性为100%,完全一致;这表明oxa-72的酵母表达载体构建成功。挑取含有Zeocin的YPDS平板上的阳性转化子并扩增,提取其DNA为模板,用目的引物和载体引物分别做PCR,分别得到约843bp和1340bp者为阳性克隆GS115（pGAPZ-oxa72）;以不含oxa-72的空质粒pGAPZaA电转化GS115所得到的阳性克隆GS115（pGAPZαA）用目的引物扩增时无特异性产物,只能用载体引物扩增出约540bp的片段。用培养72h的GS115（pGAPZ-oxa72）的蛋白提取物做Western blot可以得到单一的特异条带,这说明重组蛋白能特异地与抗His-Tag抗体结合,而对照GS115（pGAPZαA）和GS115则没有得到特异条带。分别滴加头孢硝噻吩后,含有oxa-72基因的阳性克隆GS115（pGAPZ-oxa72）的菌体悬液和上清均可在十分钟内由淡黄色变为红色,而不含oxa-72基因的阳性克隆GS115（pGAPZαA）及未转化的GS115菌株的菌体悬液和上清均不变色,观察时间延长至半小时以上亦无改变,这表明,菌体和上清中均有OXA-72蛋白的表达,且所表达的OXA-72碳青霉烯酶均有活性。镍柱纯化表达产物,得到的蛋白纯度为95%,纯化回收率达40%。纯化所得重组蛋白的等电点为6.37。结论:成功构建了OXA-72的表达载体,在毕赤酵母中成功的表达并分离纯化了具有酶活性的OXA-72,其等电点为6.37。这为下一步其功能性质的研究奠定了基础。
论文目录
相关论文文献
- [1].获得碳青霉烯耐药革兰阴性杆菌感染的机制及危险因素研究进展[J]. 广东化工 2020(01)
- [2].耐碳青霉烯类大肠埃希菌临床分离情况及碳青霉烯酶基因研究[J]. 诊断学理论与实践 2019(06)
- [3].我院碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌分子流行病学研究[J]. 标记免疫分析与临床 2020(05)
- [4].基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的价值[J]. 浙江医学 2020(16)
- [5].呼吸与危重症医学病房分离的碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌的分子流行病学[J]. 中华医院感染学杂志 2020(17)
- [6].多黏菌素联合用药治疗产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌体外研究进展[J]. 中国临床药理学杂志 2016(24)
- [7].多重耐药肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶的检测和分析[J]. 国际检验医学杂志 2016(24)
- [8].耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌基因检测及其同源性分析[J]. 中国抗生素杂志 2017(01)
- [9].应用碳青霉烯酶失活法检测产碳青霉烯酶鲍曼不动杆菌[J]. 中国感染与化疗杂志 2017(01)
- [10].耐药性细菌碳青霉烯酶检测方法研究进展[J]. 标记免疫分析与临床 2017(03)
- [11].某院院内耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌分子流行病学研究[J]. 中华实验和临床感染病杂志(电子版) 2017(02)
- [12].耐亚胺培南鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因研究[J]. 热带医学杂志 2017(08)
- [13].碳青霉烯酶检测方法的研究进展[J]. 中国实验诊断学 2016(08)
- [14].碳青霉烯类抗生素耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶和整合子的检测[J]. 中国抗生素杂志 2015(05)
- [15].微生物关于碳青霉烯酶耐药机制的研究[J]. 赤峰学院学报(自然科学版) 2015(22)
- [16].肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶检测方法的研究进展[J]. 中国医学装备 2020(02)
- [17].《碳青霉烯耐药革兰阴性杆菌感染预防与控制技术指引》解读[J]. 微生物与感染 2020(02)
- [18].呼吸病区碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的分子流行病学分析[J]. 国外医药(抗生素分册) 2020(03)
- [19].住院患者获得碳青霉烯耐药革兰阴性杆菌感染的危险因素分析及列线图的构建[J]. 中国医院药学杂志 2020(17)
- [20].碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的临床特征及克隆变迁[J]. 天津医科大学学报 2020(05)
- [21].抑制剂增强碳青霉烯类灭活法对革兰阴性杆菌碳青霉烯酶初步分类的评价[J]. 临床检验杂志 2018(01)
- [22].碳青霉烯酶的起源与进化及流行和传播[J]. 中华医院感染学杂志 2018(09)
- [23].产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌快速碳青霉烯灭活试验的评价[J]. 中国感染与化疗杂志 2018(05)
- [24].耐碳青霉烯类雷氏普罗威登斯菌耐药机制研究[J]. 分子诊断与治疗杂志 2018(05)
- [25].关于肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶特性及耐药趋势分析[J]. 数理医药学杂志 2017(02)
- [26].产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌耐药机制及流行病学研究进展[J]. 国际检验医学杂志 2016(23)
- [27].3种检测碳青霉烯酶试验的方法学比较[J]. 中国妇幼保健 2016(10)
- [28].碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌耐药机制及分子流行病学研究[J]. 安徽医科大学学报 2016(06)
- [29].肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的研究进展[J]. 检验医学与临床 2015(12)
- [30].耐碳青霉烯类鲍氏不动杆菌碳青霉烯酶基因检测研究[J]. 中华医院感染学杂志 2015(17)