论文题目: 猪2型圆环病毒ELISA诊断方法及猪2型圆环病毒-伪狂犬病病毒二价基因工程疫苗研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖
作者: 琚春梅
导师: 陈焕春,熊远著
关键词: 猪型圆环病毒,基因,表达,方法,重组伪狂犬病病毒,二价基因工程疫苗免疫原性
文献来源: 华中农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 猪2型圆环病毒(PCV2)是近年来新发现的动物病毒之一,该病毒与猪的多种疾病综合征有关,特别是仔猪断奶后多系统衰竭综合征,该病最早于1991年在加拿大西部发现,其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等,病原学及血清学调查表明,该病在许多国家都广泛存在,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。为了了解PCV2在我国的流行现状以及研制安全、高效的疫苗用于PCV2感染的防制,本研究对PCV2 ELISA诊断方法及PCV2-PRV二价基因工程疫苗进行了研究,主要研究内容如下: 1.PCV2 ORF2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 采用PCR方法从包含PCV2全基因组的重组质粒pT-PCV中扩增PCV2 ORF2基因的完整编码区,将其克隆到pMD18-T载体后,构建了重组质粒pTORF2,经序列测定证实,该基因未发生任何碱基突变。已有报道证实ORF2蛋白N端41 aa是其在细胞内的核定位信号,为了克服全长ORF2基因在大肠杆菌中表达时表达量低或不表达的缺陷,我们采用酶切方法截去了ORF2基因5’-端的部分核定位序列,并对截短后的ORF2片断进行了表达。具体方法是用BalI和SalI双酶切pTORF2,回收含ORF2基因的小片段,并将其插入pGEX-KG原核表达载体的SmaI和SalI位点之间,构建原核表达质粒pGEX-ORF2,将该质粒转化E.coli BL21,经IPTG诱导后GST-ORF2融合蛋白得到了表达,大小与预期结果相符,且表达蛋白可与PCV2标准阳性血清反应,具有免疫学活性。 2.PCV2 ELISA诊断方法的建立及应用 SDS-PAGE分析表明,GST-ORF2融合蛋白在细菌裂解液的上清及沉淀中均存在,但主要位于裂解液的上清中,因此我们采用两种方法分别对沉淀和上清中的融合蛋白进行了提取。对于沉淀中的包涵体,我们选用十二烷基肌氨酸钠(SKL)对包涵体进行溶解,并通过TE(pH8.0)透析复性获得有活性的融合蛋白。对于上清中的可溶性蛋白,我们采用谷胱苷肽琼脂糖凝胶进行纯化,结果表明用该方法提取的融合蛋白纯度很高,但获得量较低。 为了确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数,我们对GST-ORF2可溶性蛋白和包涵体蛋白分别进行了方阵滴定,结果表明可溶性蛋白与标准阴、阳性血清的非特异性反应较低,更适宜用作诊断抗原。但考虑到包涵体蛋白提取费用低,且在对阴、阳性血清进行稍高倍数稀释时可以降低非特异性反应,从而达到与可溶性蛋白相当的诊断效果,因此我们选用GST-ORF2包涵体蛋白为ELISA方法的包被抗原。按照方阵滴定确定的抗原最佳包被浓度(1.23μg/mL)包被酶标板,建立PCV2 ELISA诊断方法,并对其进行了特异性、重复性和稳定性试验,结果表明该方法特异性、重复性良好,且在4℃可以保存至少12个月。与PCV2间接免疫荧光试剂盒的对比
论文目录:
摘要
ABSTRACT
缩略语表
第1章 文献综述
1.1 猪圆环病毒及其相关疾病研究进展
1.1.1 病毒的发现
1.1.2 病毒的理化特性
1.1.3 病毒的增殖特性
1.1.4 病毒的分子生物学研究进展
1.1.4.1 PCV基因组结构
1.1.4.2 PCV复制模式研究
1.1.4.3 PCV转录模式研究
1.1.4.4 ORF2基因研究进展
1.1.5 PCV的流行病学
1.1.5.1 PCV1的流行病学
1.1.5.2 PCV2的流行病学
1.1.6 与PCV2有关的疾病
1.1.6.1 猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)
1.1.6.2 猪皮炎／肾病综合征(PDNS)
1.1.6.3 PCV2相关性繁殖障碍
1.1.6.4 猪呼吸道病复合症(PRDC)
1.1.6.5 先天性震颤及中枢神经系统疾病
1.1.7 PCV2的致病机理
1.1.7.1 免疫刺激
1.1.7.2 免疫抑制
1.1.8 诊断方法研究
1.1.8.1 病原学方法
1.1.8.2 血清学方法
1.1.9 PCV2相关疾病的防制
1.1.10 PCV2相关疾病的疫苗研究
1.1.11 PMWS动物模型的研究
1.1.11.1 GN猪动物模型的研究
1.1.11.2 CD猪动物模型的研究
1.1.11.3 CF猪动物模型的研究
1.1.12 潜在的公共卫生学意义
1.2 伪狂犬病病毒作为动物病毒疫苗活载体的研究
1.2.1 动物病毒作为疫苗活载体的优越性及其特点
1.2.2 伪狂犬病病毒概述
1.2.3 伪狂犬病病毒作为活病毒载体的可行性及应用前景
第2章 研究目的和意义
第3章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 毒株与细胞
3.1.2 菌种与质粒
3.1.3 本研究中所用的寡核苷酸引物
3.1.4 主要药品及试剂
3.1.5 主要培养基
3.1.6 血清
3.1.7 缓冲液
3.1.7.1 质粒提取用缓冲液
3.1.7.2 SDS-PAGE缓冲液
3.1.7.3 Western blotting缓冲液
3.1.7.4 GST融合蛋白纯化缓冲液
3.1.7.5 ELISA缓冲液
3.1.7.6 Southern blotting缓冲液
3.1.7.7 其它缓冲液
3.1.8 实验动物
3.2 实验方法
3.2.1 病毒的增殖
3.2.1.1 PCV2的增殖
3.2.1.2 PRV的增殖
3.2.2 PRV病毒基因组的提取
3.2.3 PCR扩增与检测
3.2.3.1 构建表达质粒用ORF2全基因的PCR扩增与检测
3.2.3.2 构建转移质粒用ORF2全基因的PCR扩增与检测
3.2.3.3 截去核定位序列的ORF2基因的PCR扩增与检测
3.2.3.4 ORF1全基因的PCR扩增与检测
3.2.4 PCR产物的回收与纯化
3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.2.6 连接产物的转化
3.2.7 重组质粒的PCR快速鉴定
3.2.8 质粒的制备
3.2.8.1 质粒的小量制备
3.2.8.2 质粒的大量制备
3.2.9 重组细菌的诱导表达
3.2.10 重组蛋白包涵体的提取
3.2.10.1 用于SDS-PAGE电泳的包涵体提取
3.2.10.2 用于ELISA包被抗原的包涵体的提取
3.2.11 可溶性GST融合蛋白的纯化
3.2.11.1 表达GST融合蛋白的重组细菌的诱导表达
3.2.11.2 50％谷胱苷肽琼脂糖凝胶悬液的制备
3.2.11.3 可溶性GST融合蛋白的纯化
3.2.12 PCV2 ELISA方法的建立
3.2.12.1 PCV2 ELISA抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定
3.2.12.2 PCV2 ELISA操作步骤
3.2.12.3 PCV2 ELISA阴阳性界限的确定
3.2.12.4 特异性试验
3.2.12.5 重复性试验
3.2.12.6 稳定性和保存期试验
3.2.12.7 PCV2 ELISA与间接免疫荧光抗体检测试剂盒的比较试验
3.2.13 共转染
3.2.14 空斑筛选纯化
3.2.15 PCR检测外源基因在重组病毒中的整合
3.2.16 SDS-PAGE电泳
3.2.17 Western blotting
3.2.18 间接免疫荧光试验
3.2.19 Southern blotting
3.2.19.1 探针的制备
3.2.19.2 转印
3.2.19.3 转印膜的干燥与固定
3.2.19.4 预杂交和杂交
3.2.19.5 洗膜
3.2.19.6 免疫检测
3.2.20 重组病毒的增殖及二价基因工程疫苗的制备
3.2.21 二价基因工程疫苗的动物试验
3.2.22 病毒TCID_(50)的测定
3.2.23 病毒微量中和试验
3.2.24 细胞免疫的检测
3.2.24.1 外周血单核细胞的分离
3.2.24.2 淋巴细胞增殖反应试验
第4章 结果与分析
4.1 猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
4.1.1 PCV2 ORF2基因的PCR扩增
4.1.2 PCV2 ORF2基因PCR产物的克隆与鉴定
4.1.3 GST-ORF2融合表达的原核表达质粒的构建与酶切鉴定
4.1.4 GST-ORF2融合蛋白在大肠杆菌中的表达
4.1.5 GST-ORF2融合蛋白的Western blotting分析
4.1.6 GST-ORF2融合蛋白在细菌裂解液中的分布
4.1.7 GST-ORF2融合蛋白包涵体的提取与纯化
4.1.8 细菌裂解液上清中GST-ORF2融合蛋白的纯化
4.2 猪2型圆环病毒ELISA诊断方法的建立及应用
4.2.1 GST-ORF2包涵体蛋白及可溶性蛋白浓度的测定
4.2.2 ELISA抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
4.2.2.1 GST-ORF2包涵体蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
4.2.2.2 GST-ORF2可溶性蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的确定
4.2.3 PCV2 ELISA阴阳性界限的确定
4.2.4 PCV2 ELISA方法的特异性试验
4.2.5 PCV2 ELISA方法的重复性试验
4.2.5.1 批内重复性试验
4.2.5.2 批间重复性试验
4.2.6 PCV2 ELISA方法的稳定性和抗原的保存期试验
4.2.7 PCV2 ELISA与间接免疫荧光检测方法(IIF)的比较
4.2.8 PCV2 ELISA方法的临床应用
4.3 表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建
4.3.1 表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬病病毒构建的策略
4.3.2 表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的结构
4.3.3 PCV2 ORF2基因的PCR扩增
4.3.4 重组转移质粒pgGORF2的构建与鉴定
4.3.5 重组病毒TK~-／gG~-／ORF2~+的筛选与纯化
4.3.6 重组病毒TK~-／gG~-／ORF2~+的PCR鉴定
4.3.7 重组病毒TK~-／gG~-／ORF2~+的Southern blotting鉴定
4.3.8 重组病毒TK~-／gG~-／ORF2~+中ORF2基因的表达检测
4.4 表达PCV2 ORF1和ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建
4.4.1 表达PCV2 ORF1和ORF2基因的重组伪狂犬病病毒构建的策略
4.4.2 表达PCV2 ORF1和ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的结构
4.4.3 PCV2 ORF1和ORF2基因的PCR扩增
4.4.4 重组转移质粒pIEORF1ORF2的构建与鉴定
4.4.5 重组病毒TK~-／gE~-／gI~-／ORF1-ORF2~+的筛选与纯化
4.4.6 重组病毒TK~-／gE~-／gI~-／ORF1-ORF2~+的PCR鉴定
4.4.7 重组病毒TK~-／gE~-／gI~-／ORF1-ORF2~+的Southern blotting鉴定
4.4.8 重组病毒TK~-／gE~-／gI~-／ORF1-ORF2~+中融合蛋白的表达检测
4.5 重组病毒的遗传稳定性
4.6 外源基因的插入对重组病毒在细胞上增殖滴度的影响
4.7 二价基因工程疫苗的制备
4.8 二价基因工程疫苗的小鼠动物试验
4.8.1 伪狂犬病病毒的中和抗体水平检测
4.8.2 PCV2 ELISA抗体水平检测
4.8.3 疫苗免疫小鼠对伪狂犬病病毒的攻毒保护效果
4.9 TK~-／GE~-／GI~-／ORF1-ORF2~+对断奶仔猪的免疫原性试验
4.9.1 伪狂犬病病毒的中和抗体水平检测
4.9.2 伪狂犬病病毒ELISA抗体水平检测
4.9.3 PCV2 ELISA抗体水平检测
4.9.4 PCV2特异性的淋巴细胞增殖试验
第5章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 PCV2 ORF2基因的克隆与表达
5.1.2 GST-ORF2融合蛋白的纯化
5.2.1.1 包涵体蛋白的提取与纯化
5.2.1.2 可溶性蛋白的纯化
5.1.3 PCV2 ELISA方法的建立
5.1.4 PCV2 ELISA方法与间接免疫荧光试剂盒的比较
5.1.5 PCV2 ELISA方法的临床应用
5.1.6 伪狂犬病病毒通用转移载体
5.1.7 共转染与空斑纯化
5.1.8 重组病毒的Southern blotting鉴定
5.1.9 外源基因在重组病毒中的表达
5.1.10 重组病毒诱导的免疫反应
5.2 结论
参考文献
致谢
附录
发布时间: 2005-12-05
参考文献
- [1].鸭圆环病毒的分子流行病学调查及诊断方法的建立[D]. 张兴晓.山东农业大学2009
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- [5].猪Ⅱ型圆环病毒—伪狂犬重组病毒活疫苗SA215（C）株的构建及其部分生物学特性研究[D]. 王印.四川农业大学2006
- [6].猪圆环病毒2型人工感染和重组腺病毒基因工程疫苗研究[D]. 王先炜.南京农业大学2006
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