构树DREB转录因子及木质素合成代谢相关基因的克隆及功能分析

论文摘要

构树（Broussonetia papyrifera L.）为桑科构树属落叶乔木,广泛分布于我国大部分地区。它是我国重要的经济林木,其树皮纤维品质优良,自古就是造纸的优良原料;而且它的环境适应性强,是迅速绿化荒山、荒滩和盐碱地的理想树种。对构树这些特性的深入研究和开发利用具有非常重要的生产现实意义。为了探讨构树应答环境胁迫的分子机制和木质素合成代谢的规律,本论文开展了抗逆转录因子和木质素代谢相关基因的分离、克隆以及功能分析等工作,为通过转基因技术在分子水平改良构树提供理论依据和技术保障。目前,取得如下的研究进展:1.采用RACE的克隆方法,从构树中克隆到一个DREB类转录因子,将其命名为BpDREB。该基因序列全长为1384bp,编码一个由330个氨基酸组成的蛋白。序列分析表明:BpDREB基因具有DREB转录因子所特有的核定位信号、DNA结合域以及转录激活域;它与其他已知的DREB基因除了在保守的AP2/EREBP结构域处具有很高的同源性外,在其它的区域同源性不高。利用Southern杂交证实该基因是以单拷贝的形式存在于构树基因组DNA中。Northern杂交分析表明BpDREB基因的表达受高盐、干旱环境逆境的诱导,而不受低温胁迫所诱导,并且其表达不依赖于ABA的调控。2.构建两个在酵母中表达的重组载体pAD-BpDREB和pLexA BD-BpDREB,通过两个独立的酵母单杂交试验验证构树DREB蛋白的DNA结合域和转录激活域。将这两个融合表达载体分别转入酵母菌株JM4271和酵母菌株EGY48,并分别在SD/-His + 10 mM 3-AT和SD/ -Leu-Ura-His的平板上筛选转化子,同时进行显色鉴定以及β-半乳糖苷酶活性的定量测定,从而检测2个报告基因的表达情况。试验结果表明:构树DREB蛋白具有DREB转录因子的两大功能结构域,即DNA结合域与转录激活域,能够特异地识别DRE元件,并能激活下游目标基因的表达。3.构建在植物中正向过量表达的双源表达载体p3301-121-BpDREB,将其转入农杆菌EHA105中。通过沾花法直接转化拟南芥,获得T1代转BpDREB基因植株。用PCR和Gus染色的方法对转基因拟南芥进行了分子检测。并对转基因

论文目录

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• 英文摘要
• 缩写表
• 第一章 引言
• 1 转录因子及其在植物抗逆反应中的作用
• 1.1 植物逆境应答中的转录因子
• 1.1.1 AP2/EREBP 转录因子家族
• 1.1.2 DREB 亚家族转录因子
• 1.2 转录因子与植物抗逆途径
• 2 木质素生物合成途径及分子调控机制
• 2.1 木质素的组成与分布
• 2.1.1 木质素的组成
• 2.1.2 木质素的分布
• 2.2 木质素单体的生物合成机制
• 2.2.1 起始反应
• 2.2.2 羟基化反应
• 2.2.3 甲基化反应
• 2.2.4 连接反应
• 2.2.5 还原反应
• 2.2.6 木质素单体的聚合
• 2.3 木质素单体生物合成的多样性
• 2.4 木质素生物合成的分子调控
• 2.4.1 起始反应的生物调控
• 2.4.2 羟基化反应的生物调控
• 2.4.3 甲基化反应的生物调控
• 2.4.4 连接反应的生物调控
• 2.4.5 还原反应的生物调控
• 3 构树分子改良的重要意义
• 3.1 构树生物学特性
• 3.2 构树的用途
• 3.2.1 环境适应性强
• 3.2.2 纤维品质优良
• 3.3 构树应用中存在的问题及分子改良的重要意义
• 第二章 构树中编码 DREB 转录因子基因的克隆及特性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料培养及胁迫处理
• 1.1.2 菌株
• 1.1.3 克隆载体
• 1.1.4 酶与试剂
• 1.1.5 溶液
• 1.1.6 培养基类
• 1.1.7 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 构树DREB基因3′端cDNA的克隆
• 1.2.2 构树DREB基因5′cDNA 的克隆
• 1.2.3 构树BpDREB 基因全长的克隆及生物信息学分析
• 1.2.4 构树BpDREB 基因的组织特异性表达模式分析
• 1.2.5 Southern 杂交检测构树BpDREB 的同源基因
• 1.2.6 Northern 杂交分析BpDREB 基因在逆境胁迫下的表达模式
• 2 结果与分析
• 2.1 构树DREB 转录因子基因的全长cDNA 的克隆
• 2.1.1 BpDREB 基因3′端序列的克隆
• 2.1.2 BpDREB 基因5′端序列的克隆
• 2.1.3 BpDREB 基因的全长cDNA 的克隆
• 2.2 构树BpDREB 基因的生物信息学分析
• 2.2.1 BpDREB 基因的序列特征分析及编码蛋白的结构功能预测
• 2.2.2 BpDREB 蛋白的空间结构预测
• 2.2.3 BpDREB 蛋白与其它 DREB 类蛋白的同源性比对和系统进化树分析
• 2.3 构树BpDREB 基因的基因组DNA 的结构分析
• 2.4 构树BpDREB 基因的拷贝数分析
• 2.5 构树BpDREB 基因的组织特异性表达分析
• 2.6 构树BpDREB 基因在不同胁迫条件下的表达模式分析
• 3 讨论
• 第三章 构树 DREB 转录因子 DNA 结合域与转录激活域的验证
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株与质粒
• 2.2 酵母培养基
• 2.3 酵母单杂交系统中使用的溶液及缓冲液
• 2.4 酵母单杂交
• 2.5 其他的试验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 构建能在酵母中表达的pAD-BpDREB 和pLexA BD-BpDREB 两个重组载体
• 3.1.1 重组质粒pAD-BpDREB 构建
• 3.1.2 重组质粒pLexA BD-BpDREB 构建
• 3.2 构树 BpDREB蛋白与DRE元件相互作用的研究
• 3.3 构树 BpDREB蛋白的转录激活能力的研究
• 4 讨论
• 第四章 构树 BpDREB 基因在拟南芥中的异源表达及其耐逆性分析.
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及载体
• 2.1.3 试验中所用试剂盒与药品
• 2.2 方法
• 2.2.1 各种酶切、连接反应和大肠杆菌感受态细胞的制备及转化过程
• 2.2.2 农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.3 拟南芥的转化
• 2.2.4 转基因拟南芥的筛选
• 2.2.5 转基因拟南芥的PCR 检测
• 2.2.6 转基因拟南芥的GUS 染色检测
• 2.2.7 转基因拟南芥的耐盐性分析
• 2.2.8 转基因拟南芥的耐冻性分析
• 2.2.9 转基因拟南芥的ABA 依赖性分析
• 2.2.10 转基因拟南芥叶片的叶绿素含量测定
• 3 结果与分析
• 3.1 表达载体p3301-121-BpDREB的构建
• 3.2 含表达载体p3301-121-BpDREB农杆菌的检测
• 3.3 转基因拟南芥的获得与检测
• 3.3.1 转基因拟南芥的获得
• 3.3.2 转基因拟南芥T1代植株PCR检测与Gus检测
• 3.3.3 转基因拟南芥T2代植株RT-PCR 检测
• 3.4 转基因拟南芥 T3代植株抗逆性分析
• 3.4.1 转基因拟南芥T3代植株耐盐性分析
• 3.4.2 转基因拟南芥T3代植株耐冻性分析
• 3.4.3 转基因拟南芥T3代植株对ABA的敏感性分析
• 4 讨论
• 第五章 构树 CCoAOMT 基因的克隆及特性分析
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株及载体
• 2.2 方法
• 2.2.1 构树中编码CCoAOMT 基因的克隆
• 2.2.2 各种CCoAOMT 的氨基酸序列比对与系统进化树构
• 2.2.3 构树BpCCoAOMT 基因编码蛋白的功能结构位点分析
• 2.2.4 构树BpCCoAOMT 基因编码蛋白的同源建模
• 2.2.550 uthern 杂交分析构树BpCCoAOMT 基因的拷贝
• 2.2.6 构树BpCCoAOMT 基因的组织特异性表达模式分析
• 3 结果与分析
• 3.1 构树BpCCoAOMT基因的全长cDNA克隆
• 3.1.18 pCCoAOMT 基因3′端序列的克隆
• 3.1.28 pCCoAOMT 基因5′端序列的克隆
• 3.1.38 pCCoAOMT 基因全长cDNA 的克隆
• 3.2 构树BpCCoAOMT 基因的结构特征分析
• 3.3 构树CCoAOMT 蛋白的氨基酸序列比对和系统进化树分析
• 3.4 构树CCoAOMT 蛋白的功能结构位点与功能结构域的预测
• 3.5 构树CCoAOMT 蛋白的空间结构分析
• 3.6 构树BpCCoAOMT 基因的组织特异性表达分析
• 3.7 构树BpCCoAOMT 基因的拷贝数分析
• 4 讨论
• 第六章 构树 F5H 基因的克隆及特性分析
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料的培养
• 2.1.2 菌株、载体和试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 构树F5H基因的克隆
• 2.2.2 构树F5H蛋白的氨基酸序列比对与系统进化树构建
• 2.2.3 构树 BpF5H 基因编码蛋白的功能结构位点分析及功能结构域的预测
• 2.2.4 构树BpF5H基因编码蛋白的三级结构预测
• 2.2.5 Southern 杂交检测构树BpF5H 基因的拷贝数
• 2.2.6 BpF5H基因的组织特异性表达模式分析
• 3 结果与分析
• 3.1 构树 BpF5H 基因全长cDNA 的克隆
• 3.1.1 BpF5H 基因3′端序列的克隆
• 3.1.2 BpF5H 基因5′端序列的克隆
• 3.1.3 BpF5H 基因的全长cDNA 的克隆
• 3.2 构树BpF5H基因的结构特征分析
• 3.3 构树BpF5H基因的系统进化树分析和氨基酸序列比对
• 3.4 构树 F5H 蛋白的功能结构域的预测与功能结构位点的分析
• 3.5 构树F5H蛋白的三级空间结构
• 3.6 构树BpF5H基因的拷贝数分析
• 3.7 构树BpF5H基因的组织特异性表达分析
• 4 讨论
• 第七章 杂交构树离体培养再生体系的建立
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 愈伤组织的获得
• 2.2.2 不定芽的形成
• 2.2.3 不定芽伸长、生根和移栽
• 2.2.4 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 不同2,4-D的浓度对愈伤组织形成的影响
• 3.2 两种培养基对三种外植体愈伤组织形成的影响
• 3.3 不同BA 的浓度对不定芽形成的影响
• 3.4 不定芽的生根和移栽
• 4 讨论
• 结论与创新点
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、博士期间发表的学术论文与专利申请