双基因转染对大鼠骨髓基质干细胞增殖和成骨分化的影响

论文摘要

高能量的创伤,骨髓炎,骨肿瘤等造成的大段骨缺损是困扰骨科医生的难题。骨组织工程研究为骨缺损的治疗提供了一种良好的途径。但工程化人工骨植入体内后能否成活依赖于能否实现有效血管化以从宿主获得足够的营养。血管化问题成为制约工程化人工骨应用于临床的瓶颈。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一种特异的与血管生长有关的因子,能增加血管的通透性,刺激内皮细胞的增殖和迁移,促进新生血管的形成。但是,VEGF诱导的新生血管渗漏性强,不成熟,难以发挥正常功能。血管生成素（Angiopoietin-1,ANG-1）在血管的塑形中起重要作用,可以募集血管周细胞和平滑肌细胞,使新生血管结构保持完整。本课题组拟构建编码人VEGF165和ANG-1双基因的腺病毒载体pAd-VIA,以期转染大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）促进组织工程骨植入体内后的快速血管化。然而,转染双基因后,BMSCs的生物学活性是否会受影响,尚不清楚。本实验旨在研究腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,外源基因体外表达情况,及转染对大鼠BMSCs增殖及成骨分化能力的影响,为下一步构建具有血管化功能的组织工程人工骨修复大段骨缺损奠定理论基础。1重组合腺病毒载体pAd-VIA的制备及滴度测定目的制备携带人血管内皮细胞生长因子（VEGF165）和血管生成素-1（ANG-1）双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA,为下一步实验提供基因转染工具。方法将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因的腺病毒质粒P-VIA用PacI酶切使之线形化,进而使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒,通过绿色荧光蛋白（GFP）表达,光镜下细胞形态的改变来评价,并进行大量扩增,利用50%组织培养感染剂量法（TCID50）检测病毒滴度。结果腺病毒质粒转染QBI-293A细胞8d后光镜下可见细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变（CPE）;荧光显微镜下可见GFP表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后获得高滴度的腺病毒载体。病毒滴度为2×1010PFU/ml。结论成功构建携带人VEGF165和ANG-1双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA,为组织工程人工骨血管化的研究奠定基础。2双基因转染大鼠BMSCs体外表达的鉴定及对其增殖的影响目的探讨携带人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）和血管生成素-1（ANG-1）双基因的腺病毒表达载体pAd-VIA转染大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的体外表达及对BMSCs增殖的影响。方法将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因的重组合腺病毒载体pAd-VIA体外转染大鼠BMSCs,通过绿色荧光蛋白（GFP）表达、Western-blotting、酶联免疫吸附分析（ELISA）方法检测外源基因的表达,利用MTT法检测感染复数（multiplicity of infection ,MOI）分别为50、100、200、400不同浓度腺病毒转染后对BMSCs的增殖活性的影响。结果重组腺病毒载体pAd-VIA体外转染大鼠BMSCs后,有大量的GFP表达,Western-blotting检测显示,转染组与VEGF165和ANG-1抗体结合,在45KD和14.4KD左右出现印迹条带;ELISA结果显示:转染组第1、2、3d,上清中的VEGF165浓度和ANG-1浓度持续增加,未转染组几乎未检测到外源基因的表达,差异有统计学意义（P<0.01）;不同浓度的腺病毒载体转染BMSCs后,促进细胞增殖,细胞生长曲线上移,在1、3、5、7d转染组的OD值均大于未转染组,差异有统计学意义（P<0.01）,第9d,细胞进入平台期,转染组和未转染组的OD值差异无统计学意义（P>0.05）。结论重组腺病毒pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,外源基因在体外得到有效表达,同时在观察时间内可以促进大鼠BMSCs的增殖。3双基因转染对大鼠BMSCs成骨分化潜能的影响目的研究联合转染人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）和血管紧张素-1（ANG-1）双基因对大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）成骨分化潜能的影响。方法将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒载体pAd-VIA体外转染大鼠BMSCs,应用含维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠的诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化。实验分为四组:A:腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B:BMSCs诱导组; C:腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D:单纯BMSCs组。通过碱性磷酸酶（ALP）染色和活性的测定、I型胶原和骨钙素免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对大鼠BMSCs成骨分化潜能的影响。结果重组腺病毒载体pAd-VIA体外转染大鼠BMSCs后,A组和B组的ALP染色、I型胶原和骨钙素免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性。ALP活性表达具有时间相关性,3d开始表达,7d到达高峰,在7和14d,A、B组与C组和D组之间ALP表达均具有统计学差异（P<0.01）,A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异（P>0.05）。结论腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 第一部分 重组合腺病毒载体 pAd-VIA 的制备
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 附图
• 第二部分 双基因转染大鼠 BMSCs 体外 表达的鉴定及对其增殖能力的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 附图
• 第三部分 双基因转染对大鼠 BMSCs 成骨分化潜能的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 附图
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢