基于D1蛋白酶结构的抑制剂先导化合物的设计与合成

论文摘要

D1蛋白酶（CtpA）是广泛存在于绿色植物叶绿素中的一种多肽加工酶。D1蛋白酶的功能是剪切D1蛋白前体（pD1）8～16个氨基酸延伸端,形成用于PSⅡ氧释放中心（OEC）锰簇原子组装的成熟D1蛋白（mD1）。现有研究表明,D1蛋白酶是绿色植物进行光合作用所必需,并且具有低含量,高同源性,分布广的特点,可以作为新型广谱高效除草剂的新型靶标。基于D1蛋白酶结构开展新型除草剂先导化合物的设计和合成,对于满足当前农业生产对高效低毒除草剂的需求和解决除草剂使用出现的越来越严重的抗性问题具有重要意义。目前仅仅有一篇D1蛋白酶抑制剂的研究报道,尚没有关于D1蛋白酶抑制剂的商业化品种。本文的前期工作在斜生栅藻D1蛋白酶晶体结构数据的基础上,同源模建高等植物菠菜D1蛋白酶的三维结构,通过虚拟筛选获得了多个系列的化合物作为D1蛋白酶抑制剂先导化合物的结构信息。本文通过合理设计和合成,得到四大类化合物合计90个,所有目标化合物经1H NMR、MS验证,部分化合物同时经元素分析,13C NMR验证,并获得了结构较为复杂的异嗯唑噻唑哌啶脲类部分代表性化合物的晶体,通过单晶X-射线衍射进一步确证了其分子结构。对全部化合物进行了活体生物活性测试,部分化合物进行了离体生物活性研究,初步确认了异噁唑噻唑哌啶脲化合物具有D1蛋白酶抑制剂先导化合物的特征,为进一步的研究奠定了良好的基础。本文具体内容如下:1、阐述了基于靶标大分子结构的农药研发策略,系统综述了D1蛋白酶及其抑制剂的研究现状,提出了本论文的研究思路和研究方案。2、利用1,3-偶极环加成形成异噁唑环,以酰胺键与赖氨酰脲连接,获得了异噁唑酰赖氨酰脲类目标化合物共21个（ILU 1～21）。采用平皿法测定了这些化合物对两种模式植物油菜和稗草的抑制活性,初步探讨了这个系列化合物的分子结构与生物活性的关系。研究发现,化合物脲端取代基不变,异噁唑苯基取代基邻对位都为氯时,化合物除草活性较高;异噁唑苯基取代基不变,脲端中含有杂环吗啡啉时,化合物具有比较好的生物活性。该骨架化合物中,改变脲基的取代基对化合物活性影响较大。3、利用β-二酮酯与羟胺环化得到异噁唑甲酸酯,酯氨解后,通过Lawesson试剂转化为硫酰胺,与卤代酮反应得到异噁唑噻唑甲酸酯,经过肼解,与相应的酰氯或异氰酸酯反应得到异噁唑基噻唑甲酰肼类目标化合物共14个（ITH 1～14）。活体生物活性测试表明,酰肼脲类化合物活性普遍优于比酰肼酰基类。该骨架部分化合物对油菜和稗草的除草活性表现出一定的选择性。该两类化合物溶解性都较差,需要进一步优化其结构来提高这类化合物的生物利用度。4、利用1,3-偶极环加成和Hansztch噻唑合成法得到异噁唑基噻唑基哌啶衍生物,与酰氯、异氰酸酯或异硫氰酸酯反应,得到两类合计43个异噁唑基噻唑基哌啶基碳酰胺或硫代碳酰胺目标化合物（ITP 1～43）。第二类化合物为刚性结构的异噁唑并环己烷并噻唑的哌啶碳酰胺化合物。活体生物活性测试表明,第二类目标化合物的除草活性有普遍的提高。综合比较两类化合物的生物活性与结构的关系,可知在异噁唑苯环上有取代基时,苯环2,4位是比较重要的取代基引入位置,且氟原子的引入能提高化合物活性;在脲端,对氟苯基的引入能够改善化合物活性;异噁唑环及哌啶酰胺的结构可能是比较重要的结构单元。刚性六元环连接异噁唑和噻唑环也在一定程度上提高化合物对油菜的抑制率。5、利用咪唑啉三酮与胺偶联,亚胺基还原后与相应的酰氯反应得到5-氨基咪唑啉2,4-二酮类化合物共12个（H1～12）。活性测试显示,环上3位甲酰基取代的化合物活性优于苯基取代的化合物活性。环外5位NH上取代基变化对化合物活性有较大影响。咪唑啉-2,4-二酮环上3位和环外5位NH可能是重要的衍生位置。6、在实验室前期生物提纯天然菠菜D1蛋白酶和重组菠菜D1蛋白酶的工作基础上,利用HPLC技术,测定异噁唑噻唑哌啶类化合物ITP 16,ITP 21,ITP 22,ITP 26,ITP 29,ITP 42,ITP43对D1蛋白酶水解24肽的抑制作用,其中ITP21对D1蛋白酶的抑制常数Ki值为1.3μM,属竞争性抑制。利用表面等离子共振（SPR）技术测定了化合物ITP21与D1蛋白酶的抑制作用。数据显示,在0.1 mM浓度下,化合物对酶的抑制率为47%。经过两种离体活性方法的测定,初步确定了异噁唑噻唑类化合物的作用靶标为D1蛋白酶。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 本论文的创新点
• 第一章 绪论
• §1.1 引言
• §1.2 基于受体大分子结构合理设计农药
• 1.2.1 基于靶标结构的药物分子设计在农药研发的应用
• §1.3 D1蛋白酶文献综述
• 1.3.1 光合系统Ⅱ（PSⅡ）
• 1.3.2 D1蛋白酶的作用底物——D1蛋白前体和剪切产物——D1蛋白
• 1.3.3 D1蛋白酶的发现和基本性质
• 1.3.4 D1蛋白酶的功能及作用机理
• 1.3.5 D1蛋白酶的体外作用环境
• 1.3.6 D1蛋白酶的晶体结构
• 1.3.7 D1蛋白酶抑制剂的研究进展
• §1.4 论文设计思想和研究内容
• 1.4.1 课题的提出
• 1.4.2 设计思路和研究内容
• 参考文献
• 第二章 异（?）唑甲酰赖氨酰脲类化合物的合成及生物活性
• §2.1 引言
• 2.1.1 异（?）唑药理作用及其在农药方面的应用
• 2.1.2 异（?）唑合成方法
• §2.2 异（?）唑甲酰赖氨酰苯基脲的合成
• 2.2.1 实验部分
• 2.2.2 结果与讨论
• §2.3 异（?）唑甲酰赖氨酰取代脲的合成
• 2.3.1 实验部分
• 2.3.2 结果与讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 第三章 异（?）唑噻唑酰肼类化合物的合成及生物活性
• §3.1 引言
• 3.1.1 噻唑的药理作用及其在农药方面的应用
• 3.1.2 噻唑的合成方法
• §3.2 异（?）唑噻唑酰肼类化合物的合成
• 3.2.1 实验部分
• 3.2.2 结果与讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 第四章 5-烷基-3-取代苯基异（?）唑噻唑哌啶类衍生物的合成及生物活性
• §4.1 引言
• §4.2 5-甲基-3-取代苯基异（?）唑噻唑哌啶类衍生物的合成
• 4.2.1 实验部分
• 4.2.2 结果与讨论
• §4.3 5-环己基-3-取代苯基异（?）唑噻唑哌啶类衍生物的合成
• 4.3.1 实验部分
• 4.3.2 结果与讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 第五章 3-取代-5-N-甲酰基异丙氨基酰基咪唑啉-2,4-二酮的合成及生物活性
• §5.1.引言
• 5.1.1 咪唑啉-2,4-二酮的发现及药理作用
• 5.1.2 咪唑啉2,4-二酮的合成方法
• §5.2 3-N-取代-5-异丙氨基酰基咪唑啉-2,4-二酮的合成
• 5.2.1 实验部分
• 5.2.2 结果与讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 第六章 目标化合物对D1蛋白酶的离体抑制活性研究
• §6.1 引言
• 6.1.1 HPLC测定D1蛋白酶与多肽底物,抑制剂相互作用的理论基础
• 6.1.2 SPR的基本原理
• §6.2 HPLC法测定化合物对酶的离体抑制活性
• 6.2.1 实验部分
• 6.2.2 结果和讨论
• §6.3 SPR法测定化合物对酶的离体抑制活性
• 6.3.1 实验部分
• 6.3.2 结果与讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 论文总结
• 在校期间发表（待发表）的科研成果
• 致谢