禽传染性支气管炎病毒S1基因自杀性DNA疫苗的研究

论文摘要

本研究采用本实验室pIBV—S1质粒（DQ288927）构建自杀性DNA疫苗。通过PCR扩增在S1基因两端引入BamHⅠ酶切位点，经酶切插入自杀性DNA疫苗载体pSCA1，构建了自杀性DNA疫苗pSCA1-S1质粒，经由菌落PCR、酶切及测序鉴定目的基因被成功克隆至自杀性DNA疫苗载体pSCA1，且方向正确。以1：20的配比加入脂质体作佐剂，制备了IBV S1基因的自杀性DNA疫苗。为证实所构建自杀性DNA疫苗pSCA1-S1质粒的正确表达，分别取等量的重组质粒pSCA1-S1、常规IBV S1基因DNA疫苗质粒pcDNA-S1、空载体pSCA1转染Vero细胞。48h后经间接免疫荧光试验观察发现，pSCA1-S1以及pcDNAS1转染组细胞浆均可见特异性亮绿色荧光，pSCA1空载体组无荧光为阴性。证实自杀性DNA疫苗载体能成功表达S1基因。为评价IBV自杀性DNA疫苗的免疫效果，分别用构建的自杀性DNA疫苗pSCA1-S1、常规DNA疫苗pcDNAS1、空载体pSCA1和IBV灭活疫苗、PBS液对照，免疫非免疫健康雏鸡。自免疫后每周采血分离血清连续五周，采用间接ELISA试验检测血清特异性抗体IgG，结果表明：自杀性DNA疫苗产生针对IBV的特异性血清抗体，免疫后第二周上升到峰值，随后开始下降，其抗体水平与常规IBV DNA疫苗差异不显著（P＞0.05）。用流式细胞仪（FACS）测定各组CD3+、CD4+、CD8+动态变化，结果显示：自杀性DNA疫苗pSCA1-S1组CD3+水平在14d和28d差异显著高于常规IBV DNA疫苗组（P＜0.05）；CD4+水平在21d、35 d差异显著高于常规IBV DNA疫苗组（P＜0.05）；CD8+水平只在35d差异显著高于常规IBV DNA疫苗组（P＜0.05）。表明自杀性DNA疫苗能诱导机体产生高水平的细胞免疫。攻毒保护试验结果表明：pSCA1-S1组攻毒相对保护率为60％；pcDNAS1组免疫鸡只相对保护率低于pSCA1-S1，为50％。本研究采用IBV S1基因构建自杀性DNA疫苗对鸡进行免疫，并对其免疫效果进行评价，在国内外还未见报道。本研究为研制IBV“自杀性”DNA疫苗提供了基础材料和科学依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 禽传染性支气管炎病毒（IBV）主要结构蛋白编码基因的研究进展
• 1.2 禽传染性支气管炎病毒DNA疫苗的研究进展
• 1.2.1 IB弱毒疫苗
• 1.2.2 IB灭活疫苗
• 1.2.3 IB基因工程疫苗
• 1.3 自杀性DNA疫苗
• 1.3.1 自杀性DNA疫苗的构建及作用机理
• 1.3.2 自杀性DNA疫苗的优点
• 1.3.3 自杀性DNA疫苗国内外研究进展
• 1.4 关于IB疫苗免疫效果的评价
• 1.5 本研究的前期工作基础
• 1.6 存在的问题
• 1.7 本研究的创新点及目的意义
• 2. 实验材料
• 2.1 毒株、细胞与菌种
• 2.2 非免疫鸡
• 2.3 主要试剂
• 2.4 主要仪器
• 2.5 主要溶液配制
• 3. 实验方法
• 3.1 引物的设计合成和目的基因获得
• 3.2 自杀性DNA疫苗表达质粒的构建及鉴定
• 3.3 S1基因在转染细胞中的表达
• 3.4 S1基因自杀性DNA疫苗的制备
• 3.5 动物免疫实验
• 3.6 免疫效果检测
• 3.6.1 IBV S1基因血清抗体的检测
• +、CD4⁺、CD8⁺数量的检测'>3.6.2 T淋巴细胞亚类CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺数量的检测
• 3.7 攻毒保护试验
• 4. 结果
• 4.1 自杀性DNA疫苗真核表达质粒的构建及鉴定结果
• 4.2 S1基因在转染细胞中的表达情况
• 4.3 脂质体包裹的S1基因自杀性DNA疫苗
• 4.4 S1基因自杀性DNA疫苗免疫效果的检测
• 4.4.1 S1基因血清抗体检测结果
• +、CD4⁺、CD8⁺数量检测结果'>4.4.2 T淋巴细胞亚类CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺数量检测结果
• 4.5 攻毒保护试验结果
• 5. 分析与讨论
• 5.1 自杀性DNA疫苗的载体
• 5.2 脂质体与自杀性DNA疫苗
• 5.3 细胞转染实验结果差异分析
• 5.4 自杀性DNA疫苗诱导的体液免疫反应
• 5.5 自杀性DNA疫苗诱导机体产生细胞免疫
• 5.6 免疫效果检测
• 5.7 自杀性DNA疫苗对动物的免疫保护
• 6. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文