斑痣盘菌目茎生种的分类及针叶树生散斑壳属分子生物学研究

论文摘要

斑痣盘菌目（Rhytismatales）是世界菌物资源中的一个重要组成部分。本文采用现代菌物学技术,从形态解剖学、个体发育学、生态与地理分布等方面对斑痣盘菌目部分茎生种进行了较深入的分类研究。同时,采用10个重复性好的随机引物对针叶树生散斑壳属（Lophodermium Chevall.）的22个菌株进行ISSR-PCR扩增反应,通过ISSR分析结果结合表型性状的比较和分析,进一步明确了针叶树生散斑壳属若干种内和种间的亲缘关系。主要研究结果如下:1.以Darker（1967）、Cannon&Minter（1986）、Kirk et al.（2001）等人提出的分类观点为主要依据,对采自安徽天堂寨国家森林公园、黄山风景区以及保藏于安徽农业大学森保教研室（AAUFP）的标本进行鉴定、分类。研究了异盘菌属（Ascodichaena）的多皱异盘菌（A.rugosa）,散斑壳属（Lophodermium）的葛藤散斑壳（L.puerariae）、茎生散斑壳（L.caulinum）、茶生散斑壳（L.camelliicola）、三尖杉散斑壳（L.cephalotaxi）,齿裂菌属（Coccomyces）的小齿裂菌（C.leptideus）、台湾齿裂菌（C. taiwanensis）,以及皮下盘菌属（Hypoderma）的野珠兰皮下盘菌（H.stephanandrae）8个种,其中多皱异野盘菌为中国新纪录科、属、种,葛藤散斑壳和茎生散斑壳为新种。编制了二叉式分种检索表,各种均附有形态解剖学特征的描述与图解以及寄主、生境的记载,并加以讨论。2.利用改良的氯化苄法对22个针叶树生散斑壳属（Lophodermium）菌株进行DNA提取。通过对模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度以及退火温度等条件进行优化,建立了该类菌物ISSR-PCR反应的最佳体系,即在15μ反应体积中,DNA模板（45ng/μl） 2.0μl,随机引物（10μM） 0.6μl,MgCl2（25mM）1.51μl,dNTPs（10mM）0.3μl,Taq酶（5U/μl）0.3μl,10×PCR buffer1.5μl,ddH2O 8.8μl。利用ISSR分子标记技术对源于安徽黄山风景区以及天堂寨国家森林公园的22个针叶树生散斑壳属菌株进行了基因组亲缘关系的分析。采用筛选出的10个随机引物,通过ISSR-PCR扩增反应,共获得扩增条带167条,其中特异性条带160条,占95.8%;通过欧氏最短距离中的类平均法聚类,得到各菌株之间的遗传距离在5.93-7.41之间。另外,在遗传距离7.12处,将22个供试菌株分为5类。通过ISSR分析结果结合表型性状的比较和分析,同种或近似种的菌株基本上能很好地聚在一起,不同种之间也能较好地区分;这与表型性状分类的结果基本一致。由此可见,ISSR技术在种内和近似种间系统学研究中具有较好的适用性。同时论证了子囊果埋生位置,子座、唇、子囊、子囊孢子等形态学特征以及寄主种类差异等在该类菌物种水平分类上的重要性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• Ⅰ文献综述
• 1 斑痣盘菌的经济重要性
• 2 斑痣盘菌分类历史回顾
• 3 斑痣盘菌的生态与地理分布
• 4 斑痣盘菌的传统鉴定与系统分类方法
• 4.1 多相分类
• 4.2 多性状综合分类
• 5 分子生物学技术在真菌种类鉴定及系统分类上的应用
• 6 菌物分类研究中分子标记的选择
• 6.1 选择分子标记的标准
• 6.2 选择ISSR分子标记技术的依据
• 6.2.1 ISSR分子标记技术的特点
• 6.2.2 ISSR分子标记技术在真菌分类中应用
• Ⅱ引言
• Ⅲ 斑痣盘菌科的分类
• 1 材料与方法
• 1.1 标本采集与整理
• 1.2 实验仪器
• 1.3 显微检查
• 1.3.1 外部形态观察与描述
• 1.3.2 切片显微检查
• 1.3.3 描述及绘图
• 2 有关属的特征
• 2.1 异盘菌属Ascodichaena
• 2.2 齿裂菌属Coccomyces
• 2.3 皮下盘菌属Hypoderma
• 2.4 散斑壳属Lophodermium
• 2.5 分种检索表
• 3 种的描述
• 3.1 多皱异盘菌Ascodichaena rugosa新纪录种
• 3.2 葛藤散斑壳Lophodermium puerariae sp.nov.新种
• 3.3 茎生散斑壳Lophodermium caulinum sp.nov.新种
• 3.4 小齿裂菌Coccomyces leptideus
• 3.5 台湾齿裂菌Coccomyces taiwanensis
• 3.6 野珠兰皮下盘菌Hypoderma stephanandrae
• 3.7 茶生散斑壳Lophodermium camelliicola
• 3.8 三尖杉散斑壳Lophodermium cephalotaxi
• Ⅳ 针叶树生散斑壳属部分种内及近似种间的ISSR分析
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株及其来源
• 1.2 菌丝培养
• 1.3 仪器及试剂
• 1.3.1 主要仪器设备
• 1.3.2 DNA提取所需试剂及化学试剂
• 1.4 DNA的提取及质量检测
• 1.5 引物的筛选
• 1.6 ISSR-PCR反应参数的优化
• 1.7 引物退火温度对ISSR-PCR反应结果的影响
• 1.8 ISSR-PCR扩增产物处理
• 1.9 聚类分析
• 2 结果与分析
• 2.1 引物的筛选
• 2.2 不同参数对ISSR-PCR反应结果的影响
• 2.1.1 模板DNA浓度对ISSR扩增的影响
• 2.1.2 引物浓度对ISSR扩增的影响
• 2+浓度对ISSR扩增的影响'>2.1.3 Mg²⁺浓度对ISSR扩增的影响
• 2.1.4 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响
• 2.1.5 Taq DNA聚合酶浓度对ISSR扩增的影响
• 2.3 引物退火温度对ISSR-PCR反应结果的影响
• 2.4 ISSR扩增结果
• 2.5 聚类分析
• Ⅴ 结论
• Ⅵ 讨论
• 1 关于斑痣盘菌科系统学研究问题
• 2 ISSR分子标记技术的优、缺点
• Ⅶ参考文献
• 图版Ⅰ
• 图版Ⅱ
• 图版Ⅲ
• 图版Ⅳ
• 致谢
• 作者简介