产核黄素工程菌B. subtilis PY的代谢工程研究

论文摘要

本文围绕核黄素生物合成反应,研究了异源核黄素操纵子的扩增对工程菌核黄素合成的影响。在此基础上,对产核黄素枯草芽孢杆菌进行了代谢工程改造:通过在宿主菌株中分别扩增zwf基因,缺失ptsG基因,表达异源vgb基因等手段,构建了一系列产核黄素枯草芽孢杆菌基因工程菌。本文得到的主要结果如下:利用生物信息学原理从已经完成全基因测序的三种微生物（B. cereus ATCC 10987, B. cereus ATCC 14579和Geobacillus stearother mophilu）中寻找核黄素操纵子序列,对其进行核黄素操纵子基因的注释。通过核黄素缺陷型菌株的营养互补实验,证实了三种异源核黄素操纵子能够在枯草芽孢杆菌中表达。通过在B. subtilis RH13中表达三种不同的P43-rib（异源操纵子）,发现蜡样芽孢杆菌（B. cereus ATCC 14579）核黄素操纵子对枯草芽孢杆菌核黄素产量的影响最大。将含有P43-ribB.cereus ATCC 14579的片段整合到B.subtilis RH33染色体上得到的工程菌B. subtilis PY,在含8 %葡萄糖的发酵培养基中核黄素产量达到4.3 g/l,与出发菌相比提高了近27 %。在此基础上,研究了在工程菌B. subtilis PY中过量表达zwf基因（编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶）对菌体核黄素合成的影响。实验结果表明:zwf基因的过量表达增加了PP途径的通量,提高了核黄素合成前体物5-磷酸核酮糖（Ru5P）的胞内浓度,在含8 %葡萄糖的发酵培养基中核黄素产量达到5.4 g/l与出发菌相比提高了约25 %。其次,考察了缺失工程菌B. subtilis PY的ptsG基因对其生理和核黄素产量的影响。实验结果表明:该基因的缺失降低了菌株对葡萄糖的吸收速率,EMP和TCA耦联性加强,在一定程度上减少了发酵副产物的大量积累,最大限度地将反应底物转化为菌体和目标产物。在含8 %葡萄糖的发酵培养基中最高菌体浓度增加22%,核黄素产量提高达到5.1 g/l,与出发菌相比提高了19 %,但与此同时发酵周期由48 h延长至72 h。对工程菌及其出发菌通量分布的计算结果表明:ptsG基因缺失的工程菌减少了EMP途径的通量,增强了TCA途径的通量,弱化了溢流代谢,底物转化率由出发菌的0.01 mol核黄素/mol葡萄糖提高到0.016 mol核黄素/mol葡萄糖。最后,本文研究了在B. subtilis PY中表达vgb基因对工程菌生理和核黄素产量的影响。实验结果表明:vgb基因的表达提高宿主菌氧化磷酸化效率,ATP/ADP由出发菌的1.3增加到工程菌的3.2。含vgb基因的工程菌在5 l发酵罐中流加发酵48 h,发酵结果显示菌体浓度增加28 %,核黄素产量达到13.3 g/l,比出发菌核黄素产量提高了约20 %。工程菌及其出发菌通量分布的计算结果表明:vgb基因的表达使工程菌PP途径通量增加,有效调节EMP途径和TCA循环途径的耦合性,在一定程度上消弱了溢流代谢。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 核黄素简介
• 1.2 枯草芽孢杆菌中核黄素的生物合成
• 1.2.1 枯草芽胞杆菌简介
• 1.2.2 核黄素生物合成途径
• 1.2.3 核黄素生物合成基因及其所编码酶的功能
• 1.3 产核黄素枯草芽孢杆菌工程菌的研究
• 1.3.1 基于诱变技术的产核黄素枯草芽孢杆菌的构建
• 1.3.2 基于基因工程技术的产核黄素枯草芽孢杆菌的构建
• 1.3.3 基于代谢工程技术的产核黄素枯草芽孢杆菌的研究
• 1.4 生物信息学与共享生物信息资源介绍
• 1.4.1 生物信息学研究内容
• 1.4.2 共享生物信息资源的介绍
• 1.5 枯草芽孢杆菌的糖代谢
• 1.5.1 枯草芽孢杆菌的糖吸收
• 1.5.2 葡萄糖对枯草芽孢杆菌碳代谢的影响
• 1.6 枯草芽孢杆菌的磷酸戊糖途径
• 1.6.1 磷酸戊糖途径反应过程及其相关酶
• 1.6.2 影响磷酸戊糖途径通量的因素
• 1.7 透明颤菌血红蛋白（VHb） 及其研究进展
• 1.7.1 透明颤菌（Virtreoscilla，SP.） 的概述
• 1.7.2 透明颤菌血红蛋白基因的克隆、表达和调控
• 1.7.3 透明颤菌血红蛋白生理功能和作用机制
• 1.7.4 透明颤菌血红蛋白的应用
• 1.8 选题背景及研究思路
• 1.8.1 选题背景
• 1.8.2 技术路线与研究内容
• 第二章 异源核黄素操纵子的表达对枯草芽孢杆菌核黄素生物合成的影响
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒与菌种
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 大肠杆菌转化
• 2.2.3 大肠杆菌质粒的提取
• 2.2.4 PCR 反应体系
• 2.2.5 DNA 片段的回收纯化
• 2.2.6 酶切体系
• 2.2.7 内切酶的失活
• 2.2.8 连接体系的建立
• 2.2.9 3’凹端的补平
• 2.2.10 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.11 枯草芽孢杆菌Spizizen 转化
• 2.2.12 枯草芽孢杆菌染色体DNA 的提取
• 2.2.13 利用α互补筛选目的转化子
• 2.2.14 菌落PCR
• 2.2.15 枯草芽孢杆菌总RNA 的提取
• 2.2.16 枯草芽孢杆菌总RNA 的分析和定量
• 2.2.17 枯草芽孢杆菌总RNA 中基因组DNA 的去除
• 2.2.18 Real-time RT-PCR 操作过程
• 2.2.19 发酵液中核黄素的测定
• 2.2.20 工程菌遗传稳定性的测定方法
• 2.3 实验结果与讨论
• 2.3.1 异源核黄素操纵子中各基因的注释
• 2.3.2 异源核黄素操纵子能否在枯草芽孢杆菌中表达的验证
• 2.3.3 对核黄素产量影响最大的异源核黄素操纵子的筛选
• 2.3.4 异源核黄素操纵子的扩增对工程菌核黄素合成的影响
• 2.3.5 异源核黄素操纵子促进核黄素产量提高机理的探讨
• 2.4 本章小结
• 第三章 zwf 基因的扩增对枯草芽孢杆菌核黄素生物合成的影响
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 质粒与菌种
• 3.1.2 实验仪器
• 3.1.3 实验试剂
• 3.1.4 培养基和培养方法
• 3.1.5 主要溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 发酵中液残糖含量的测定
• 3.2.2 发酵液中有机酸的测定
• 3.2.3 细胞干重的测定
• 3.2.4 粗酶液细胞悬浮液的制备
• 3.2.5 蛋白质浓度的测定——考马斯亮蓝法
• 3.2.6 胞内物质的提取（PCA）方法
• 3.2.7 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6DH） 活力的测定
• 3.3 实验结果与讨论
• 3.3.1 含Pxyl-zwf 融合片段整合质粒的构建
• 3.3.2 含Pxyl-zwf 融合片段的产核黄素基因工程菌的构建
• 3.3.3 对zwf 基因扩增工程菌及其出发菌发酵性能的研究
• 3.3.4 zwf 基因括增工程菌及其出发菌胞内物质的测定
• 3.4 本章小结
• 第四章 ptsG 基因敲除对枯草芽孢杆菌核黄素生物合成的影响
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 质粒与菌种
• 4.1.2 实验仪器
• 4.1.3 实验试剂
• 4.1.4 培养基和培养方法
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 乙酰磷酸转移酶（PTA） 活力的测定
• 4.2.2 菌体代时的测定
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 ptsG 基因缺失载体的构建
• 4.3.2 ptsG 基因缺失工程菌的构建
• 4.3.3 ptsG 基因缺失工程菌及其出发菌代时的测定
• 4.3.4 ptsG 基因缺失工程菌及其出发菌乙酰磷酸转移酶活力测定
• 4.3.5 ptsG 基因缺失工程菌及其出发菌发酵性能的研究
• 4.3.6 产核黄素枯草芽孢杆菌生化反应网络模型
• 4.3.7 ptsG 基因缺失工程菌及其出发菌代谢通量分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 透明颤菌血红蛋白对枯草芽孢杆菌核黄素生物合成的影响
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 质粒与菌种
• 5.1.2 实验仪器
• 5.1.3 实验试剂
• 5.1.4 培养基和培养条件
• 5.1.5 主要溶液
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 CO-差光谱法测定VHb
• 5.2.2 蛋白质的SDS-PAGE （聚丙烯凝胶电泳） 方法
• 5.2.3 胞内物质ATP 和ADP 的测定
• 5.2.4 微氧条件的控制
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 含PsacB-vgb 融合片段整合质粒的构建
• 5.3.2 含PsacB-vgb 融合片断的产核黄素工程菌的构建
• 5.3.3 vgb 基因的表达对枯草杆菌在微氧条件下生理特性的影响
• 5.3.4 含vgb 基因的工程菌及其出发菌ATP/ADP 的测定
• 5.3.5 含vgb 基因的工程菌及其出发菌的流加发酵
• 5.3.6 含vgb 基因的工程菌及其出发菌代谢通量分析
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论和创新点
• 6.1.1 主要结论
• 6.1.2 创新点
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢