斑蝥素和去甲斑蝥素抗膀胱肿瘤作用的实验研究

论文摘要

斑蝥是鞘翅目（Coleoptera）芫青科（Meloidae）斑芫青属（Mylabris）昆虫的俗称,是有效抗肿瘤天然药物。斑蝥素（Cantharidin,CA）是斑蝥抗肿瘤的有效成份,其是一种半帖烯毒素,可从虫体提取或人工合成。因其口服及静脉注射具有强烈的泌尿系统和消化系统刺激作用,不易为患者所接受而限制了它的使用。去甲斑蝥素（Norcantharidin,NCTD）是CA的衍生物,与CA有类似的抗肿瘤作用,且其毒性明显低于CA。尽管祖国传统医学在临床实践中早已将斑蝥提取物用于某些肿瘤的治疗中,但将其提取物及其衍生物作为腔内灌注预防与治疗浅表膀胱肿瘤国内外均未见报告。目的研究CA和NCTD对膀胱肿瘤细胞体外的生长抑制作用及其作用机理,进一步研究CA和NCTD膀胱灌注治疗小鼠膀胱肿瘤的作用及其机制,为斑蝥提取物及其衍生物膀胱灌注治疗人膀胱肿瘤提供实验依据。内容CA和NCTD抗膀胱肿瘤细胞系的体外实验研究,CA和NCTD膀胱灌注对小鼠膀胱和血液影响的安全性研究,CA和NCTD膀胱灌注治疗小鼠膀胱肿瘤的实验研究。方法使用不同浓度的CA和NCTD对人膀胱肿瘤EJ、T24、SqCa细胞和小鼠膀胱肿瘤细胞MB49进行体外培养,取药物作用不同时间的细胞进行MTT实验和FCM Annexin V-PI双染色法检测细胞凋亡率,进而选择出一种抑制膀胱肿瘤细胞增殖的有效药物,并筛选出最佳药物浓度和作用时间。用最佳浓度的药物与细胞共同培养,光学显微镜和电子显微镜、丫啶橙荧光染色、Hoechst33258荧光染色法观察细胞的形态学变化,激光共聚焦显微镜观察（FITC-Annexin V/PI双染色法）MB49细胞凋亡,凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA片断化;分光光度法检测细胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性变化;Western blot法检测细胞Bcl-2和Bax表达的变化;PCR-TRAP-银染法检测端粒酶活性变化,激光共聚焦显微镜测定MB49细胞胞浆内Ca2+浓度变化。5倍最佳抑制细胞增殖浓度的CA和NCTD进行小鼠膀胱灌注,常规病理和电镜检测小鼠膀胱和FCM检查血液淋巴细胞亚群变化。复制小鼠膀胱原位肿瘤种植模型后将筛选出最佳浓度的药物对小鼠膀胱进行灌注,观察记录实验组和对照组小鼠生存时间、肿瘤生长情况、小鼠生存情况（包括体重、活动、饮食、血尿的出现等）,免疫组化验证CA和NCTD对小鼠膀胱肿瘤的抑制作用。结果CA和NCTD在体外对人膀胱肿瘤EJ、T24细胞和小鼠膀胱肿瘤MB49细胞增殖有明显抑制作用,在一定的浓度和时间范围内呈明显的时间-效应关系和浓度-效应关系,抑制EJ和T24细胞的最佳药物浓度CA为20μmol/L、NCTD为60μmol/L;抑制MB49细胞的最佳药物浓度CA为40μmol/L、NCTD为60μmol/L;NCTD对于SqCa细胞增殖的抑制作用不明显,而CA对于SqCa细胞增殖的抑制作用明显,最佳药物浓度为60μmol/L;用最佳药物浓度的CA和NCTD与膀胱肿瘤细胞共同培养,随着作用时间延长Caspase分光光度法检测发现Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性增加;Western blot显示,T24和MB49细胞Bcl-2的表达均逐渐减弱,Bax的表达均逐渐增强。PCR-TRAP-银染法检测显示,MB49细胞的端粒酶活性随着CA作用时间的延长而逐渐减弱;激光共聚焦显微镜测定MB49细胞胞浆内Ca2+浓度明显增加。C57BL/6小鼠原位膀胱肿瘤模型的成瘤率为96.7%。CA组治愈率为80%,NCTD为60%,均明显高于对照组的13.3%。TUNEL检测显示,用药组残存肿瘤细胞出现凋亡,越近肿瘤表面,凋亡越明显。灌注后,血液淋巴细胞亚群各组无差别,用药组的膀胱移行上皮明显变薄外,无其它异常改变。各组的肝、脾、肺、心、肾未见明显损害。结论CA和NCTD体外对膀胱肿瘤细胞有良好的抑制作用,其作用机理可能与其激活Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性,增强bcl-2和减弱Bax的表达,增加胞浆中Ca2+浓度而诱导凋亡有关。硝酸银灼伤、MB49膀胱灌注建立起来的C57BL/6小鼠原位膀胱肿瘤模型是一种较为理想的原位肿瘤模型。CA和NCTD具有明显的抗小鼠膀胱肿瘤作用,其作用机制可能为诱发肿瘤细胞凋亡。CA和NCTD膀胱灌注治疗小鼠膀胱肿瘤对膀胱及全身重要器官是安全的。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、斑蝥素和去甲斑蝥素抗膀胱肿瘤细胞系的实验研究
• 1.1 对象和方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、斑蝥素和去甲斑蝥素小鼠膀胱灌注安全性的研究
• 2.1 对象和方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、斑蝥素和去甲斑蝥素膀胱灌注治疗小鼠膀胱肿瘤的实验研究
• 3.1 对象和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述
• 斑蝥提取物及其衍生物的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢