禽流感病毒NS1蛋白与宿主蛋白NOLC1相互作用的研究

论文摘要

禽流感,是由A型流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的从呼吸系统病变到全身败血症的一种高度接触性急性传染病。NS1蛋白（nonstructural protein 1,NS1）是A型流感病毒唯一的非结构蛋白,作为流感病毒的致病因子,NS1蛋白在细胞内可与多种宿主蛋白相互作用,通过增强病毒蛋白的表达或者改变宿主蛋白的重新分布等方式,从而增强病毒的致病性和毒力。为了研究NS1蛋白在禽流感病毒复制及致病过程中的作用,在前期研究中我们已利用T7-噬菌体展示技术以高致病型（H5N1型）禽流感病毒NS1蛋白为诱饵蛋白,筛选出能够与NS1蛋白发生相互作用的宿主蛋白即人核仁磷酸化蛋白1（NOLC1）,并采用哺乳动物双杂交、免疫共沉淀技术对NS1蛋白与NOLC1蛋白两者的相互作用进行特异性验证。通过对其相互作用蛋白的筛选和鉴定,可以为进一步揭示A型流感病毒的致病机理,为禽流感的治疗提供重要的参考价值。人核仁磷酸化蛋白1（NOLC1）,是一个高度磷酸化的蛋白,呈颗粒状存在于间期细胞核核仁,当细胞进行有丝分裂时,NOLC1颗粒瓦解,均匀分布到细胞质中,与RNA聚合酶Ι相互结合,参与核仁的发生,调控rRNA基因的转录,对细胞生长、炎症发生、肝癌的发生、发展有重要的调控作用。本研究为了更深入的研究NS1蛋白与NOLC1蛋白间相互作用的生物学功能,以前期筛选出的能够与NS1蛋白相互作用的宿主蛋白NOLC1为基础,利用His-pull down技术体外进一步验证两者的相互作用。另外,采用荧光定位技术将NS1绿色荧光蛋白与NOLC1红色荧光蛋白在Hela细胞系中进行共表达,两者共定位于细胞核。在此基础上,采用基因截短技术确定NS1蛋白和筛选到的NOLC1蛋白相互作用的结构域,研究结果表明NS1蛋白的效应结构域是与NOLC1蛋白相互作用的主要结构域。本研究为了解NS1蛋白的功能提供了更多的实验数据,对进一步了解禽流感病毒在细胞内的复制提供了帮助。基于NS1蛋白能够和宿主蛋白NOLC1相互作用,将其作为抗病毒药物设计的靶位,将会扰乱NS1和细胞及病毒蛋白的相互作用,为病毒的防治提供保障手段。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 0.1 禽流感概述
• 0.1.1 禽流感流行的历史和现状
• 0.1.2 禽流感病毒的生物学特征
• 0.2 NS1 蛋白的简介
• 0.2.1 N-末端RNA 结合结构域
• 0.2.2 C-末端效应结构域
• 0.2.3 NS1蛋白的功能
• 0.2.4 NS1蛋白与宿主细胞内的多种蛋白质相互作用
• 0.3 NOLC1 蛋白的简介
• 0.4 研究与NS1 互作蛋白的意义
• 0.5 本项目研究目的及内容
• 第1章 NS1 蛋白与 NOLC1 蛋白体外分子间相互作用验证
• 1.1 前言
• 1.2 材料
• 1.2.1 细胞株、载体、细菌菌株
• 1.2.2 主要试剂
• 1.2.3 溶液配制（见附录A）
• 1.2.4 主要仪器与耗材（见附录B）
• 1.3 方法
• 1.3.1 NS1蛋白的原核表达及纯化
• 1.3.2 NOLC1 蛋白的真核表达及Western blot 分析
• 1.3.3 His-pull down 体外检测蛋白间相互作用
• 1.4 结果
• 1.4.1 NS1 蛋白诱导表达SDS-PAGE
• 1.4.2 NS1 蛋白的纯化
• 1.4.3 NOLC1 蛋白含量的测定
• 1.4.4 NOLC1 蛋白的Western blot 分析
• 1.4.5 NS1蛋白与NOLC1蛋白体外相互作用的His-pull down 结果
• 1.5 讨论
• 第2章 NS1 蛋白与 NOLC1 蛋白的细胞共定位研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 引物合成
• 2.2.2 细胞株、载体、细菌菌株
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 溶液配制（见附录A）
• 2.2.5 主要仪器与耗材（见附录B）
• 2.3 方法
• 2.3.1 pEGFP-N1-NS1 真核表达载体的构建及表达
• 2.3.2 pDsRed-C1-NOLC1真核表达载体的构建及表达
• 2.3.3 NS1蛋白与NOLC1蛋白的细胞共定位研究
• 2.4 结果
• 2.4.1 NS1 基因的克隆
• 2.4.2 真核表达载体pEGFP-N1-NS1 的构建
• 2.4.3 pEGFP-N1-NS1 真核表达载体在Hela 细胞中的表达
• 2.4.4 NOLC1基因的克隆
• 2.4.5 真核表达载体pDsRed-C1-NOLC1的构建
• 2.4.6 pDsRed-C1-NOLC1 真核表达载体在Hela 细胞中的表达
• 2.4.7 NS1 蛋白与NOLC1 蛋白的细胞共定位研究
• 2.5 讨论
• 第3章 基因截短确定 NS1蛋白与 NOLC1蛋白相互作用结构域
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 细胞株、载体、细菌菌株
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 溶液配制（见附录A）
• 3.2.5 主要仪器与耗材（见附录B）
• 3.3 方法
• 3.3.1 NS1 截短表达质粒pEGFP-N1-NS1（RBD）、pEGFP-N1-NS1（ED）构建及表达
• 3.3.2 NOLC1 蛋白的真核表达及Western blot 分析（同1.3.2）
• 3.3.3 免疫共沉淀确定NS1 蛋白与NOLC1 蛋白相互作用的结构域
• 3.4 结果
• 3.4.1 NS1 截短体基因的克隆
• 3.4.2 NS1 截短表达质粒pEGFP-N1-NS1（RBD）、pEGFP-N1-NS1（ED）构建
• 3.4.3 pEGFP-N1-NS1（RBD）、pEGFP-N1-NS1（ED）真核表达载体在293T 细胞中表达
• 3.4.4 免疫共沉淀确定NS1蛋白与NOLC1蛋白相互作用的结构域
• 3.5 讨论
• 第4章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 进一步工作的方向
• 致谢
• 参考文献
• 附录 A 试剂及其配制一览表
• 附录 B 主要仪器与耗材一览表
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况