检测Cre重组酶活性的转基因报告猪的建立

论文摘要

Cre/LoxP系统主要应用于制备人类疾病模型鼠,因此检测Cre重组酶活性的报告动物品系也全部是小鼠。由于猪与人类在解剖结构、生理学等更为接近,因此利用Cre/LoxP系统构建转基因疾病动物模型及其相应的转基因报告猪具有重要意义。为了实现Cre/LoxP转基因猪在人类疾病动物模型的应用,本实验构建了用于检测Cre重组酶活性的转基因报告猪。首先构建条件性表达绿色荧光蛋白的真核表达载体,由CMV启动子调控条件性表达绿色荧光蛋白,两个同向的LoxP位点锚定一个筛选基因与终止子,当Cre重组酶不存在时,绿色荧光蛋白由于和启动子之间有终止子的存在,绿色荧光蛋白不表达;当Cre重组酶存在时,将LoxP间的序列删除,CMV启动子启动绿色荧光蛋白的表达。将所构建的条件性表达绿色荧光蛋白的载体线性化后,用脂质体法转染到猪胚胎成纤维细胞,通过G418筛选,获得可以检测Cre重组酶活性的猪胚胎成纤维细胞,作为体细胞核移植的供体细胞。对所筛选的转基因猪胚胎成纤维细胞在基因水平、转录水平、表达水平进行了检测。并通过体细胞核移植技术,获得了11头健康的克隆猪。对所获得克隆猪进行PCR鉴定,并分离新生克隆猪尾部成纤维细胞,进行Cre重组酶的验证实验,鉴定结果表明,所获得的克隆猪均为转基因克隆猪。

论文目录

• 内容提要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第1章 转基因动物的研究概述
• 1.1 转基因动物的研究进展
• 1.2 转基因动物的应用
• 1.3 转基因动物生产程序和制作方法
• 1.4 转基因克隆动物存在的问题分析
• 1.5 展望
• 第2章 Cre/LoxP重组系统的研究进展
• 2.1 Cre/LoxP 重组系统的特性
• 2.2 Cre /LoxP 重组系统在疾病模型上的应用
• 2.3 体内检测Cre 重组酶转基因动物报告系统
• 2.4 问题与展望
• 第二篇 研究内容
• 第1章 条件性表达EGFP载体的构建
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第2章 条件性表达EGFP转基因报告猪成纤维细胞的构建
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 转基因报告猪的构建
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果
• 致谢
• 导师及作者简介
• 中文摘要
• Abstract