论文摘要
氯过氧化物酶（Chloroperoxidase,CPO）因其独特的活性中心结构而成为过氧化物酶家族中应用最广泛的酶,尤其引人注目的是它对底物具有手性识别功能,因此在不对称有机合成,生物转化,手性药物制备,环境毒物降解等领域具有诱人的应用前景。但游离CPO在高温、强酸强碱等极端条件下易变性失活,严重限制了它的产业化应用。本文基于CPO的固定化研究,提高了酶的热稳定性、催化活性以及对合成环境的适应能力,从而可为固定化酶在工业化生产中的实际应用奠定基础。酶固定化技术是实现酶重复连续使用和稳定性改善的有效手段,目前对过氧化物酶家族中其它酶的固定化报道较多,而对CPO的固定化报道较少。本文选用两种新型材料——壳聚糖膜/球和磁性微球作为载体进行CPO的固定化研究。壳聚糖作为一种高分子材料不仅来源丰富,化学性质稳定,易于通过接枝而改性,而且具有生物相容性,是一种十分理想的酶固定化载体;而磁性微球所具有的超顺磁性,使其分离过程可以通过一个钕铁硼永磁材料提供的磁场反复操作而不聚集,十分有利于亲水性的CPO与反应产物的分离及回收循环利用;同时经异硫氰酸根包覆的磁性微球表面易于酶的功能基团自组装,可达到较高的酶载量。本文通过MCD氯化活性的测定考察了CPO固定的最适条件,并研究了固定化CPO的结构和表面性质,比较了游离CPO和固定化CPO间酶学性质的差异,并将磁粒固定化CPO应用于有机合成——邻苯三酚的催化聚合反应。主要实验结果如下:1.以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂,通过共价交联法制备了壳聚糖膜（球）固定化CPO。固定化反应的最佳条件:戊二醛浓度0.8%,pH 3.5。与游离CPO相比,热稳定性、对化学变性剂尿素和过氧化氢的耐受性均有明显提高。在50℃下,温育1 h后游离CPO仅剩余0.02%的催化活性,而固定化CPO可将催化活性保留40%以上;同时当尿素浓度为1.5M时,固定化CPO基本不丧失活性,而游离CPO的活性损失超过32%;而在300μM H2O2中放置20 h后,固定化CPO保留酶活性58%,游离CPO只能保留42%。2.以xMagTM异硫氰酸根末端磁性微球为母体,通过共价结合的方法固定CPO。固定化反应的最佳条件:pH 5.5,绑定时间10 min,酶载量可达25.59 mg/g,固定化效率为75.5%。与游离CPO相比,米氏常数Km值增大,固定化CPO与底物亲和力减小,热稳定性、对尿素、过氧化氢及有机溶剂的抗失活能力,以及重复使用次数均有所提高。在300μM的H2O2溶液中储存96 h后固定化CPO存留活性仍有50%,而游离CPO仅剩9%。固定化CPO重复使用16次后,其活力仍能保持最初活性的85%以上。3.因此本文研究了磁性微球固定化氯过氧化物酶对邻苯三酚的催化聚合反应。结果表明,固定化氯过氧化物酶可高效催化邻苯三酚转化为红棓酚。