论文摘要
谷胱甘肽（GSH）作为一种具有γ-谷氨酰基和巯基的生物活性三肽,是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成。GSH可清除胞内超氧物因离子和自由基,保护细胞膜的完整性,具有抗脂质氧化作用,使细胞免受伤害,从而维持细胞正常代谢。因而,GSH在食品、医药、保健、抗衰老方面的应用日益广泛。与其他生产GSH的方法（活性组织提取、化学合成和酶转化法）相比较,微生物发酵法是目前GSH工业化生产的最普遍方法之一。本论文以一株高积累GSH的产朊假丝酵母（Candida utilis WSH 02-08）为出发菌株,以实现GSH发酵高产量、高得率和高生产强度为目标,采用增加细胞密度（流加培养）、提高胞内GSH含量（前体氨基酸添加、ATP再生）以及环境胁迫等一系列技术与策略,对GSH发酵过程进行优化控制,主要研究内容如下:（1）考察了分批培养、指数速率流加和恒速流加对细胞生长和GSH合成的影响,并提出了三阶段（分批培养、指数速率流加和恒速流加）细胞高密度培养策略。分批培养时初糖（葡萄糖）浓度为15 g/L,发酵9 h时葡萄糖消耗完毕,经过12h指数速率流加（比生长速率为0.2 h-1）,和24 h恒数流加（补糖速度为5.5 g/L/h）,发酵培养45 h后,细胞密度达102 g/L,GSH浓度为981 mg/L。（2）在细胞高密度培养基础上,考察了半胱氨酸添加对GSH合成的影响,一次性添加半胱氨酸为50 mmol/L时,GSH产量达最大值1534 mg/L;由于胞内GSH的大量积累会对谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSHⅠ）活性产生反馈抑制作用,因而进一步考察低pH胁迫与半胱氨酸添加相结合对GSH合成的影响,将50 mmol/L半胱氨酸分两次（每次25mmol/L）添加并与低pH胁迫结合促进GSH合成,最终GSH总产量达1825 mg/L。（3）当半胱氨酸添加量为50 mmol/L时,发现用于GSH合成的半胱氨酸仅为其添加量的4%,为此,考察了溶氧对半胱氨酸吸收和GSH合成的影响,并提出了两阶段溶氧水平控制与半胱氨酸添加相结合的策略来促进GSH合成,结果半胱氨酸的添加量由50 mmol/L减少到30 mmol/L,添加量降低了40%,而GSH产量却达到1734 mg/L,比对照提高了13%。最后将pH胁迫和溶氧控制同时与半胱氨酸添加（添加浓度为30 mmol/L）相组合,通过低pH胁迫和两阶段溶氧控制,GSH终产量达1936 mg/L,比对照提高了26%。（4）研究摇瓶条件下细胞生长阶段谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三种氨基酸对细胞生长和GSH合成的影响,与添加谷氨酸和半胱氨酸相比,添加甘氨酸对细胞生长和GSH合成均有促进作用,当2 h时添加6 mmol/L甘氨酸,发酵到第10 h时,细胞密度和GSH产量达10.41 g/L和125 mg/L,分别比对照提高了10.1%和34.1%。（5）细胞停止生长后,加入三种氨基酸,并通过Central-Composite实验优化得到三种氨基酸最佳浓度配比（谷氨酸6 mmol/L、甘氨酸5.5 mmol/L、半胱氨酸6.5 mmol/L）,经过30 h培养,GSH总产量达278mg/L。两阶段氨基酸添加使细胞干重和GSH产量达到10.4 g/L和278 mg/L,将此策略应用于7 L罐上,细胞干重和GSH产量分别为12.81g/L和328 mg/L,进一步将两阶段氨基酸添加策略与细胞高密度培养相结合时,最终GSH产量可高达1952 mg/L,胞内GSH含量为1.81%。（6）在两阶段氨基酸添加基础上,考察了发酵后期胞内前体氨基酸浓度、ATP含量和GSHⅠ活性变化,发现GSH停止合成的主要原因是由于ATP不足所致。通过添加ATP促进GSH继续合成,当ATP添加量为3 g/L时,GSH总产量达2141 mg/L;细胞进一步经SDS处理后,ATP添加量为2 g/L时,GSH总产量可达2153 mg/L,而ATP用量则可减少33%;此外,通过补加葡萄糖和硫酸铵再生ATP促进GSH合成,结果GSH总产量为2163 mg/L,与直接添加ATP相比,成本显著下降,说明该策略具有很好的实用性。（7） H2O2胁迫对GSH合成影响结果表明,H2O2可促进GSH合成但同时又会抑制细胞生长,为此提出在细胞生长期添加低浓度H2O2和细胞停止生长时添加高浓度H2O2的H2O2多次（6 h添加1 mmol/L H2O2、8 h添加2 mmol/L H2O2、10 h添加4 mmol/L H2O2）胁迫策略,摇瓶分批发酵结束时（30 h）,GSH产量为188 mg/L,胞内GSH含量达2.05%。将此策略应用于7 L罐上,发酵30 h时细胞干重和GSH产量分别为10.21g/L和258 mg/L,进一步将此策略应用于7 L罐上和细胞高密度培养相结合,发酵结束（60 h）时,GSH产量高达1482 mg/L,胞内GSH含量为1.52%,分别比对照提高了32%和38%。同时,H2O2胁迫使胞内过氧化氢酶和GSH还原酶活性明显增强,说明CAT和GSH直接参与了清除胞内H2O2和其它活性氧离子。（8）对Na2SO4胁迫促进GSH合成机理进行初步探讨,结果表明Na2SO4胁迫可使胞内半胱氨酸含量、GSHⅠ酶活性、GSH还原酶（GR）活性显明提高,进而促进GSH合成。
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标签：谷胱甘肽论文; 产朊假丝酵母论文; 发酵过程优化论文; 细胞高密度培养论文; 氨基酸添加论文; 再生论文; 环境胁迫论文;