粘细菌Sorangium cellulosum AHB103-1产生新型抗肿瘤物质的研究

论文摘要

粘细菌是一类非常独特的革兰氏阴性菌,具有复杂的群体行为和产生丰富的药理活性次级代谢物的能力。本论文对Sorangium cellulosum AHB103-1的生物学特性进行了研究,并对它进行了分类鉴定;研究了发酵过程中产生的挥发性物质与抗肿瘤次级代谢物的关系;利用MTT实验法对抗肿瘤次级代谢物进行了活性筛选和分离纯化,得到两种具有较强抗癌活性的物质迪本霉素和米赫霉素;对迪本霉素进行了摇瓶发酵工艺条件的优化;并初步研究了它的抗肿瘤机制。对Sorangium cellulosum AHB103-1菌株进行形态学和生理生化特征的研究,根据《伯杰细菌鉴定手册》第二版（第二卷,The Proteobacteria,C部分,George M. Garrity,2005）,鉴定为纤维堆囊菌（Sorangium sp.）。采用SPME/GC/MS方法对发酵过程中菌体产生的挥发性物质进行了研究,结果表明部分化合物含量的变化曲线与抗肿瘤活性的变化曲线类似,其中乙酸和4-苯甲酰-2氢-吡喃-3-酮最为重要,它们含量的变化可以做为发酵控制的一个指标。Sorangium cellulosum AHB103-1菌株产生的次级代谢物对人肝癌细胞HepG2、小鼠黑色素瘤B16、人乳腺癌细胞MDA-MB231、人胃癌细胞SGC7901都有很高的活性,次级代谢物在不高于60℃的条件下活性基本没有变化,对强日光和紫外光不敏感,在pH38时较稳定。利用MTT法,以人肝癌细胞HepG2细胞株为模型,采用液液萃取、Sephadex LH-20柱分离、低压C18柱分离和HPLC、结晶等手段制备出2种具有较高抗肿瘤活性的物质,通过对其NMR、TOF MS/MS、UV、IR等图谱的解析,确定了它们的分子量分别为392、370 Da,分子式分别为C24H44N2O2和C18H30N2O6。根据系统命名法和国际惯例,化合物C24H44N2O2的系统名称为3,12-二乙基-1,15-二氮杂双环[13.7.0]二十二烷-2,16-二酮（[3S,12R]3,12-diethyl-1,15-diaza-bicyclo [13.7.0]docosane-2,16-dione）,拟命名为Dieobone（迪本霉素）;化合物C18H30N2O6的系统名称为2,6,7,8,20-五羟基-4,13-二氮杂四环[9.8.1. 04,9.013,19]二十烷-5-酮（ [2R,6R,7S,8R,20R]-2,6,7,8,20-pentahydroxy-4,13-diaza -tetracyclic[9.8. 1.04,9.013,19]eicosane-5-one）,拟命名为Mehyazaone（米赫霉素）。通过江南大学教育部科技查新文献检索中心对它们进行了查新（名称、结构、性质和研究现状等）,查新号为201136000L080497,国内外均未见公开文献报道与之相同结构的物质。设计了一种以葡萄糖为唯一碳源,以天冬酰胺为唯一氮源,添加1 mg/L CoCl2的简单合成培养基来研究各种营养成分包括乙酸钠、丙酸钠、甘油、各种氨基酸、无机盐以及磷酸盐的影响。简单合成培养基中添加丙酸钠能显著提高迪本霉素含量55.63%,加入乙酸钠只有略微的促进,加入甘油则会强烈抑制迪本霉素产量至46.71%。加入丝氨酸和色氨酸相应提高迪本霉素的产量100.42%和126.90%,加入苏氨酸则降低了迪本霉素产量至47.64%。不同浓度的磷酸盐对迪本霉素的产量都表现出抑制作用。在复杂发酵培养基（培养基A）发酵过程中,添加效果较好的树脂有四种:HPD100,XAD-2,XAD-16,D101。其中XAD-16大孔树脂效果最好,达54.66 mg/L。XAD-16大孔树脂较佳添加量为1525 g/L,摇瓶装液量在75125 mL/500mL时迪本霉素含量较高,发酵温度在2832℃较佳。PB实验的结果表明复杂发酵培养基中各因素影响显著的顺序为马铃薯淀粉>MgSO4·7H2O>脱脂奶粉>丝氨酸>丙酸钠>酵母粉。BB实验优化发酵培养基得到迪本霉素产量预测值最大时的各组分浓度:马铃薯淀粉12.49 g/L,脱脂奶粉9.77 g/L,MgSO4·7H2O 1.43 g/L,预测值为99.89 mg/L。验证实验迪本霉素含量为90.42 mg/L,而优化前为55.46 mg/L,提高了63.04%。迪本霉素和米赫霉素对四种肿瘤细胞株HepG2,MDA-MB231,B16和SGC7901均有良好的抗肿瘤效果。与临床药相比,迪本霉素和米赫霉素对HepG2的细胞毒作用虽然比埃博霉素B低,与表柔比星和紫杉醇类似,但都远高于依立替康和奥沙利铂。而且它们对老鼠正常脾细胞的毒活性远低于HepG2,B16,SGC7901细胞。这表明迪本霉素和米赫霉素在一定的浓度范围内对肿瘤细胞具有选择性的抑制作用,是相对安全的。倒置显微镜下观察经迪本霉素处理24 h后的HepG2细胞,可发现样品对细胞的生长表现出明显的抑制作用。荧光显微镜下观察发现HepG2细胞经迪本霉素处理后,细胞核变小、皱缩,可见致密强荧光;部分细胞核碎裂,形成凋亡小体,出现小的荧光点。扫描电镜观察发现,对照组HepG2细胞表面布满丝状微绒毛,而经迪本霉素处理后HepG2细胞膜表面微绒毛明显变稀疏直至完全消失,细胞膜上出现较多的凋亡小体,细胞核有碎裂现象出现。琼脂糖凝胶电泳结果显示经迪本霉素处理后HepG2细胞出现明显的DNA条带,包含180200 bp的寡核苷酸片段。利用流式细胞仪进行检测,结果表明:在试验浓度范围内,迪本霉素通过将细胞周期阻滞在S期来抑制HepG2细胞增殖;通过引起HepG2细胞线粒体膜电位ΔΨm下降但不影响细胞膜完整性诱导凋亡;迪本霉素通过上调Caspase-3蛋白、Bax蛋白和p53蛋白的表达量,下调Bcl-2蛋白的表达量来诱导细胞凋亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 粘细菌的分类及研究进展
• 1.1.1 粘细菌的分类
• 1.1.2 化学组成
• 1.1.3 粘细菌的研究进展
• 1.2 纤维堆囊菌的生物学特征
• 1.2.1 纤维堆囊菌的基因组
• 1.2.2 运动特性
• 1.2.3 子实体的形成
• 1.2.4 初级代谢
• 1.2.5 次级代谢
• 1.3 纤维堆囊菌产生的次级代谢物
• 1.3.1 活性物质在不同属之间的分布
• 1.3.2 纤维堆囊菌产生的活性物质种类和结构
• 1.3.3 纤维堆囊菌产活性物质的特点
• 1.3.4 纤维堆囊菌产生的次级代谢物的作用机制
• 1.3.5 纤维堆囊菌次级代谢物的生物合成途径
• 1.4 粘细菌的国内外研究现状
• 1.5 当前研究中存在的主要问题
• 1.6 本课题的主要研究内容
• 第二章 Sorangium cellulosum AHB103-1 生物学特性及发酵过程中挥发性物质的变化
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要实验仪器与设备
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 活性物质筛选培养基
• 2.1.6 肿瘤细胞株
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Sorangium cellulosum AHB103-1 生理生化特征的测定
• 2.2.2 Sorangium cellulosum AHB103-1 的分子生物学鉴定
• 2.2.3 Sorangium cellulosum AHB103-1 产生挥发性物质的测定
• 2.2.4 细胞毒活性测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 AHB103-1 的形态特征
• 2.3.2 AHB103-1 的生理生化特征
• 2.3.3 AHB103-1 的16S rDNA 测定
• 2.3.4 发酵过程中产生的挥发性物质的鉴定和分析
• 2.4 本章小结
• 第三章 Sorangium cellulosum AHB103-1 产生的抗肿瘤物质的分离纯化及结构解析
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器与设备
• 3.1.3 实验试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 肿瘤细胞株
• 3.1.6 溶剂的配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 细胞培养
• 3.2.2 细胞生长抑制率的测定 （MTT 法）
• 3.2.3 甲醇提取物的制备
• 3.2.4 稳定性试验
• 3.2.5 活性物质的分离纯化和结构解析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 代谢产物的稳定性试验
• 3.3.2 活性物质的萃取
• 3.3.3 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20 柱分离抗肿瘤代谢物
• 3.3.4 低压C-18 柱分离抗肿瘤代谢物
• 3.3.5 晶体1# 结构解析
• 3.3.6 晶体2#结构解析
• 3.4 本章小结
• 第四章 Sorangium cellulosum AHB103-1 产生迪本霉素 （Dieobone） 发酵条件的优化
• 4.1 实验材料与实验仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验仪器与设备
• 4.1.3 实验试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 活性次级代谢物的提取
• 4.2.2 迪本霉素含量的测定
• 4.2.3 细胞生长确定
• 4.2.4 还原糖的测定
• 4.2.5 基质A 发酵液的游离氨基酸分析
• 4.2.6 Plackett-Burman （PB） 和Box-Behnken （BB） 设计法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 营养成分对活性物质的影响
• 4.3.2 发酵条件的研究
• 4.3.3 发酵培养基的优化
• 4.4 本章小结
• 第五章 迪本霉素 （Dieobone） 的抗肿瘤活性及诱导肿瘤细胞凋亡相关机制的研究
• 5.1 实验材料与仪器
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验设备与仪器
• 5.1.3 实验试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 细胞毒活性测定 （采用MTT 法）
• 5.2.2 细胞毒作用的显微拍照
• 5.2.3 扫描电镜观察Dieobone 对HepG2 细胞的形态影响
• 5.2.4 荧光显微镜观察Dieobone 对凋亡细胞核变化
• 5.2.5 凝胶电泳检测Dieobone 对HepG2 细胞DNA 的影响
• 5.2.6 流式细胞仪检测Dieobone 对HepG2 细胞周期的影响
• 5.2.7 流式细胞仪检测Dieobone 对HepG2 细胞线粒体膜电位的影响
• 5.2.8 流式细胞仪检测Dieobone 对凋亡基因相关蛋白和Caspase-3 表达的影响
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 Dieobone 对肿瘤细胞系的细胞毒作用
• 5.3.2 Dieobone 的浓度对不同肿瘤细胞抑制率的影响
• 5.3.3 Dieobone 的作用时间对肿瘤细胞抑制率的影响
• 5.3.4 Dieobone 对肿瘤细胞作用机制的初步研究
• 5.4 本章小结
• 结论与展望
• 论文结论
• 存在的问题与展望
• 创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录