耐冷菌中低温蛋白酶的产酶条件优化及其性质研究

论文摘要

低温蛋白酶在低温下具有较高的催化活性,在需要低温催化的行业如洗涤、食品、奶制品、皮革加工、医药和化妆品中具有较高的应用价值,因而引起各国科学家的广泛研究和开发。本研究是从实验室保存的25株耐冷菌中进一步筛选低温蛋白酶的产生菌株。利用水解酪蛋白平板法筛选出产低温蛋白酶较好的4株菌：H8,W7,Z4和Z5。它们所产的蛋白酶活性分别为：54.6±1-6U·mL-188.1±1.2U·ml-1、64.6±2.1U·mL-1、32.5±1.9U·mL-1.对产低温蛋白酶活力最高的W7进行菌种鉴定。经形态学和生理生化鉴定,结合部分16SrDNA序列分析,确定其为假单胞菌属,命名为Pseudominas sp.W7,属于耐冷菌.为了获得耐冷菌W7最佳的产酶条件,首先是利用单因素实验研究不同碳源、氮源、复合氮源、无机盐对产酶的影响,从而确定产酶培养基的组成为葡萄糖、蛋白胨、干酪素、K2HP04.KH2P04.Cacl2.MgS04.在此基础上,采用二水平实验设计对影响产酶的因素进行显著性分析,筛选出对产酶影响显著的3个因素：葡萄糖、蛋白胨和MgS04.利用响应面分析法对筛选出的3个因素进行3水平优化,获得培养基的最优组合：葡萄糖4.25g·L-1、蛋白胨7.00g·L-1、MgSO40.14g·L-1,优化后产酶水平达到183.9U·mL-1。最终确定产酶培养基最适组成为：葡萄糖4.25g·L-1、蛋白胨7.00g·L-1、干酪素4.00g.L-1、K2HPO45.00g·L-1、KH2PO41.00g·L-1、 CaCl20.26g·L-1、MgSO40.14g·L-1。在确定最佳培养基的基础上,从最适培养温度、培养基的初始pH值、接种量、装液量和摇床转速5个方面对产酶条件进行优化。采用正交实验设计,确定耐冷菌W7最佳的产酶条件为培养温度20℃；培养基的初始pH值7.0；接种量3%；装液量20%：摇床转速100r/min.在最佳的培养条件下,培养48h时产酶达到最大值为193.2U·mL-1。耐冷菌W7在4到10代之间产低温蛋白酶比较稳定。酶学性质研究的结果表明：此酶的最适温度为35℃,而且在0℃-40℃之间比较稳定；其最适pH为9.0,在pH5.0-10.0的范围内是稳定的；Mn2+和Mg2+对酶活力有促进作用,Cu2+、Hg2+、Al3+、Pb2+、Ca2+对酶活力有一定的抑制作用；EDTA对酶的活力有抑制作用；5%的丙酮对酶促反应有明显的促进作用；对于耐冷菌W7而言,温度的变化对其低温蛋白酶的表达量和种类影响比较显著。分别在15℃、20℃和25℃C下培养耐冷菌W7,利用酶谱分析检测不同温度下低温蛋白酶的表达量和种类。结果显示,在20℃C和25℃C培养时产生两种蛋白酶分别为低温蛋白酶Ⅰ和低温蛋白酶Ⅱ,分别命名为Pro Ⅰ和Pro Ⅱ;在15℃培养时仅产分子量较大Pro Ⅰ。由此可见,Pro Ⅰ在低温培养时起主要的水解作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1. 低温微生物
• 1.2 低温蛋白酶
• 1.2.1 低温蛋白酶的应用
• 1.2.2 低温蛋白酶的来源及分类
• 1.2.3 低温蛋白酶的特征
• 1.2.4 影响低温蛋白酶表达的因素
• 1.3 低温蛋白酶研究存在的问题及发展趋势
• 1.4 课题研究的目的、意义及研究内容
• 1.4.1 课题研究的目的、意义
• 1.4.2 课题研究内容及实验思路
• 第2章 低温蛋白酶产生菌的筛选及鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 实验用药品及试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 酶活力的测定方法
• 2.2.2 初筛
• 2.2.3 复筛
• 2.2.4 生长温度
• 2.2.5 菌种鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 低温蛋白酶产生菌株的初筛结果
• 2.3.2 复筛的实验结果
• 2.3.3 生长温度
• 2.3.4 菌种鉴定的结果
• 2.4 本章小结
• 第3章 耐冷菌W7产酶条件的优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验菌株
• 3.1.2 实验药品
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 耐冷菌W7产酶培养基的优化
• 3.2.2 响应面法优化培养基的组成
• 3.2.3 耐冷菌W7产酶培养条件的优化
• 3.2.4 耐冷菌W7产酶的培养条件正交实验优化
• 3.2.5 耐冷菌W7的生长曲线和产酶曲线
• 3.2.6 耐冷菌W7产酶的传代稳定性试验
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 耐冷菌W7产酶培养基优化的结果
• 3.3.2 响应面法优化培养基的结果
• 3.3.3 产酶培养条件优化的结果
• 3.3.4 产酶条件优化正交实验结果
• 3.3.5 耐冷菌W7的生长曲线和产酶曲线
• 3.3.6 耐冷菌W7产低温蛋白酶的传代稳定性结果
• 3.4 本章小结
• 第4章 低温蛋白酶酶学性质的研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 实验药品与试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 酶的最适反应温度和热稳定性实验
• 4.2.2 酶的最适pH值和pH值稳定性实验
• 4.2.3 金属离子对酶活性影响的实验
• 4.2.4 有机溶剂及抑制剂对酶活性影响的实验
• 4.2.5 酶谱分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 酶的最适反应温度和热稳定性结果
• 4.3.2 酶的最适pH值和pH值稳定性结果
• 4.3.3 金属离子对酶活性影响
• 4.3.4 有机溶剂及抑制剂对酶活性影响
• 4.3.5 酶谱分析的结果
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢